文献分享（xenium）--肺神经内分泌癌通过血清素诱导免疫抑制性巨噬细胞，从而促进对 T 细胞衔接器药物塔拉他单抗（tarlatamab）的耐药

作者，Evil Genius

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核心问题：SCLC和LCNEC中，DLL3表达与DLL3靶向TCE（tarlatamab）临床反应之间的脱节（>90% SCLC表达DLL3，但超过一半患者无反应）提示存在耐药机制。

Graphical Abstract

• DLL3^low NEC：HES1抑制ASCL1，TPH1低表达，5-HT产生少。T细胞（TCE/ICB作用）功能正常，无免疫抑制性巨噬细胞激活 → TCE/ICB应答。
• DLL3^high NEC：DLL3抑制NOTCH/HES1，解除对ASCL1的抑制 → ASCL1激活TPH1 → 产生大量5-HT。5-HT通过HTR7受体作用于巨噬细胞，激活CREB，使其表达IL-10、ARG1、PD-L1，获得免疫抑制表型。这些巨噬细胞抑制CD8+ T细胞（增加TIM-3、TOX、减少IFN-γ/TNF-α），导致T细胞耗竭 → TCE/ICB耐药。
• 靶向5-HT/HTR7：可逆转免疫抑制，恢复TCE/ICB应答。

In Brief

识别出SCLC和LCNEC中对DLL3×CD3导向的T细胞衔接器和ICB治疗耐药的神经免疫机制。

• 肿瘤来源的血清素通过HTR7信号编程免疫抑制性巨噬细胞，抑制抗肿瘤T细胞反应并限制免疫治疗疗效。
• 同时揭示了一个治疗上可操作的脆弱性（靶向TPH1或HTR7）。

Highlights

1. DLL3^high神经内分泌肺癌通过TPH1诱导产生血清素。
2. 肿瘤来源的血清素激活免疫抑制性HTR7+巨噬细胞。
3. 血清素-HTR7轴损害TCE诱导的CD8+ T细胞免疫。
4. 靶向TPH1或HTR7恢复对TCE和PD-1阻断的敏感性。

Introduction

1. SCLC/LCNEC的临床挑战

• SCLC和LCNEC是高级别肺神经内分泌癌（NEC），临床行为侵袭性强、预后差。
• 化疗免疫治疗（ICB+细胞毒化疗）是标准治疗，但加用ICB仅使晚期SCLC患者生存延长约2个月，突显需要阐明NEC特有的免疫抑制机制。
• SCLC包括ASCL1、NEUROD1、POU2F3驱动的神经内分泌程序亚型，以及炎症状态（这些谱系定义转录因子特征低表达）。
• 炎症亚型具有免疫"热"TME，对化疗免疫治疗更敏感。因此，NEC中的神经内分泌程序促进免疫逃逸和ICB耐药，但详细机制未知。

2. 神经-免疫-肿瘤学背景

• 一些神经递质调节TME中表达特定受体和转运蛋白的免疫细胞，构成神经-免疫-肿瘤学基础。
• 肾上腺素能、胆碱能信号以及肿瘤相关神经释放的降钙素基因相关肽调节T细胞活性和抗肿瘤免疫。
• 肿瘤中的神经递质通常被认为来源于支配神经元或免疫细胞，但NEC细胞本身预期释放大量神经递质以调节免疫景观和逃避免疫。
• 然而，NEC来源神经递质如何决定TME中免疫细胞浸润动态的机制仍不清楚。

3. TCE的临床现状与耐药悖论

• 双特异性T细胞衔接器（TCE）物理连接肿瘤抗原与T细胞表面蛋白，触发抗肿瘤活性，已在血液恶性肿瘤中显示临床疗效。
• Tarlatamab是FDA批准的首个用于实体瘤的TCE，在SCLC患者中显示显著临床疗效。
• 尽管近90%的SCLC中检测到DLL3表达，但超过一半患者对DLL3靶向TCE无反应，表明原发性耐药。
• DLL3表达与DLL3+ NEC临床反应之间的这种解耦提示，一些DLL3+ NEC存在赋予TCE治疗耐药的机制。

4. 研究目标

• 对肺NEC进行综合免疫基因组分析，发现DLL3^high肿瘤通过血清素（5-HT）-HTR7轴激活免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），建立抑制性TME，促进对TCE和ICB的耐药。
• 提出靶向5-HT-HTR7轴可能克服TCE耐药并改善DLL3+ NEC临床结局。

Results

结果1、DLL3-TPH1轴塑造富含免疫抑制性TAMs的免疫抑制TME，限制肺NEC免疫治疗疗效

LCNEC多组学分析：

• 鉴于TCE在DLL3+ NEC中临床疗效有限，对DLL3表达异质性的LCNECs进行多组学分析。
• 基于DLL3蛋白水平，LCNECs分为DLL3^{negative、DLL3}low和DLL3^high组。

多重免疫组化（mIHC）分析：

• DLL3^high肿瘤中浸润的CD8+ T细胞（CD8+CD3+细胞）显著更少。
• 对肿瘤浸润免疫抑制细胞群体（包括Treg细胞FOXP3+CD4+CD3+、免疫抑制性TAMs CD206+CD68+等）的综合评估显示，免疫抑制性TAM/CD8+ T细胞比值是唯一在DLL3^high LCNECs中显著增加的参数。
• 进一步对LCNECs的RNA-seq数据进行GSEA，发现IFN-γ和IFN-α反应相关基因集在DLL3^high LCNECs中显著降低。
• 这些发现提示DLL3^high LCNECs通过丰富的免疫抑制性TAMs浸润建立低干扰素反应的免疫抑制TME。

神经递质相关通路分析：

• 分析神经递质相关通路，发现DLL3^high肿瘤中神经递质相关基因签名显著富集。
• 在神经递质相关基因中，TPH1和DDC（5-HT生物合成的关键酶基因）与DLL3表达相关性最强。
• mIHC确认DLL3^high LCNECs中TPH1表达更高，而DLL3表达与TAM募集相关的细胞因子或趋化因子无关。
• SCLCs中观察到类似发现：DLL3^high SCLCs相比DLL3^low表现出减少的CD8+ T细胞浸润和增加的免疫抑制性TAM/CD8+ T细胞比值。
• 总之，DLL3^high肺NECs的特征是TPH1表达升高和富含免疫抑制性TAMs的免疫抑制TME。

临床疗效关联：

• 使用接受tarlatamab或ICB基础方案治疗患者的治疗前肿瘤标本，检查DLL3和TPH1表达与免疫治疗疗效的关联。
• 高DLL3表达意外地与tarlatamab治疗后更短的无进展生存期（PFS）相关，尽管DLL3是其治疗靶点。
• 同样，高TPH1表达预测tarlatamab治疗后更差的PFS。
• DLL3和TPH1表达也与LCNECs和SCLCs中ICB基础化疗免疫治疗后的不利PFS相关。

• 总之，升高的DLL3和TPH1表达与免疫抑制TME和TCE或ICB基础治疗后的不良临床结局相关。

  
  

结果2、DLL3通过NOTCH-ASCL1通路调控5-HT产生

基因组分析：

• LCNECs的WES和RNA-seq数据分析显示，高TPH1表达的肿瘤频繁表现出DLL3拷贝数增加，而其他基因改变（TP53、RB1、NOTCH家族基因、FGFR1和MYC）无明确关联。
• 一致地，DLL3拷贝数增加和DLL3表达升高仅限于复合SCLC肿瘤的SCLC成分。

亚型关系：

• DLL3^high肿瘤在LCNECs和已发表SCLC队列的RNA-seq数据中表现出特别高的ASCL1表达。
• 相反，DLL3^high NECs中检测到低POU2F3表达，与先前报道POU2F3亚型与其他NEC亚型互斥一致。
• 在已发表SCLC队列中，DLL3^high SCLCs表现出比DLL3^low SCLCs更高的TPH1表达，且均分类为ASCL1^high亚型。
• mIHC分析确认高DLL3蛋白表达的SCLC细胞也显著具有更高的ASCL1表达。
• ASCL1已知直接诱导DLL3转录，提示ASCL1与DLL3-NOTCH信号通路之间的相互调控。

ASCL1-TPH1直接调控证据：

• 公共ChIP-seq数据集在人类SCLC和神经内分泌前列腺癌模型中识别出TPH1转录起始位点附近的ASCL1结合增强子，与H3K27ac富集重叠。
• ASCL1 CUT&RUN分析在两个人类SCLC细胞系（NCI-H69和Lu-135）中确认ASCL1结合在同一调控区域，支持ASCL1与TPH1之间的直接调控联系。

DLL3过表达实验：

• 在人类NEC细胞系（NCI-H69和Lu-135）中过表达DLL3：
  • 抑制NOTCH信号（NICD、REST和HES1水平降低）。
  • 同时增加ASCL1和TPH1表达以及细胞外5-HT产生。
• 这些发现与先前报道DLL3抑制NOTCH信号一致，NOTCH通常抑制ASCL1表达和神经内分泌分化。
• 进一步通过过表达NICD恢复NOTCH信号或使用RNA干扰敲低ASCL1，两者均减弱DLL3诱导的TPH1表达，表明DLL3通过NOTCH-ASCL1-TPH1轴促进5-HT产生。

体内功能验证：

• 在鼠RPP631（Rb1-/-; Trp53-/-; p130-/-）细胞中过表达DLL3，降低HES1表达并增加ASCL1和TPH1表达。
• 植入同基因小鼠后，DLL3过表达肿瘤显示对抗PD-1治疗反应降低。
• 重要的是，CD8+ T细胞耗竭消除了PD-1阻断的治疗益处并消除了对照与DLL3过表达肿瘤之间的差异。

• 这些发现表明DLL3通过激活NOTCH-ASCL1-TPH1通路、增加5-HT产生和抑制CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫促进NEC进展。

  
  

结果3、免疫抑制性TAMs在NEC的TME中表达5-HT受体HTR7

5-HT受体/转运蛋白表达谱：

• 为研究免疫抑制性TAMs如何响应5-HT，分析从肺肿瘤分离的免疫细胞亚群的转录组谱，包括效应记忆CD8+ T细胞（CD45RA-CCR7-CD8+）、效应Treg细胞（CD25^highCD45RA-CD4+）和免疫抑制性TAMs。
• 在5-HT转运蛋白和受体基因中，HTR7在免疫抑制性TAMs中特异性高表达（FPKM约10-15），而在CD8+ T细胞和Treg中几乎不表达。
• 流式细胞术确认免疫抑制性TAMs（CD206+CD68+）表面HTR7蛋白表达显著高于炎症性TAMs。

空间与单细胞验证：

• mIHC显示TPH1^high肿瘤中HTR7+免疫抑制性TAMs显著更多，且HTR7+细胞与CD206+CD68+细胞共定位。
• 单细胞RNA-seq（scRNA-seq）UMAP显示HTR7在单核/巨噬细胞群中表达，在免疫抑制性TAMs亚群中富集。
• 免疫抑制性TAMs高表达CD14、FCGR3A、LYZ、S100A8、TGFB、CD163、MRC1、PD-L1（CD274）、HLA-DRB1和IL-10，而炎症性TAMs表达较低水平的这些免疫抑制标志物。
• GOBP富集分析显示5-HT TAMs富集G蛋白偶联受体信号通路、细胞外基质组织、细胞粘附和免疫系统过程调控。

Xenium空间转录组分析：

• 对5例LCNECs进行Xenium 5K分析（1,631,669个细胞）：
  • 肿瘤细胞亚群包括SCLC-A样、SCLC-P样、基底样、腺癌样、增殖、缺氧相关和基底样细胞。
  • DLL3和TPH1共表达于SCLC-A样细胞亚群。
• 空间分布：TPH1+肿瘤细胞周围40 μm内形成"5-HT生态位"。
• 5-HT TAMs（绿色）比其他单核细胞/TAMs（灰色）更靠近TPH1+肿瘤细胞（距离显著更短）。
• 5-HT生态位内T细胞耗竭评分和M2巨噬细胞签名显著高于生态位外，表明5-HT生态位内存在更强的免疫抑制。
  

结果4、5-HT通过HTR7增强免疫抑制性TAMs的免疫抑制活性

体外实验：

• 用不同浓度5-HT处理M2-BMDMs（骨髓来源巨噬细胞），ARG1+IL-10+细胞比例剂量依赖性增加（0 μM至50 μM），在10 μM达到平台。
• PD-L1表达也剂量依赖性增加（0-100 μM）。
• 使用LysM^Cre;Htr7fl/fl小鼠的M2-BMDMs，Htr7缺失消除了5-HT诱导的ARG1、IL-10和PD-L1上调，表明5-HT通过HTR7促进免疫抑制性巨噬细胞表型。

CREB信号：

• HTR7激活cAMP依赖性CREB信号，促进巨噬细胞免疫抑制表型。
• 5-HT剂量依赖性增加M2-BMDMs中CREB和磷酸化CREB（pCREB）水平。
• 因此，NEC细胞产生的5-HT通过HTR7-CREB信号直接增强巨噬细胞的免疫抑制表型。

对CD8+ T细胞的影响：

• 5-HT单独不诱导T细胞耗竭或凋亡。
• 但与5-HT处理的M2-BMDMs共培养增加CD8+ T细胞中TOX和TIM-3表达，减少细胞因子（IFN-γ和TNF-α）产生。
• CD8+ T细胞中Htr7基因缺失对其存活、增殖或细胞因子产生无影响。

• 这些发现表明NEC来源5-HT主要作用于巨噬细胞而非直接作用于CD8+ T细胞，增强巨噬细胞介导的免疫抑制并驱动CD8+ T细胞终末耗竭。

  
  

结果5、肿瘤来源5-HT增强TAMs免疫抑制功能，从而损害ICB抗肿瘤疗效

肿瘤5-HT浓度：

• RPP631肿瘤含有显著高于结肠和脑组织（生理含5-HT）以及其他肿瘤模型（B16F10、MC38、MB49、4T1、CT9和CMT167）的5-HT浓度。

Tph1敲低实验：

• 在RPP631肿瘤中敲低Tph1：
  • 降低瘤内5-HT水平。
  • 减少CD206+ TAMs的丰度和抑制表型。
  • 降低ARG1、IL-10和PD-L1表达，而不影响TAM相关趋化因子受体。
• 这些发现表明5-HT-HTR7信号通过扩增和激活TAMs而非增强其募集来促进免疫抑制。

TAM重编程与CD8+ T细胞：

• Tph1敲低增加CD8+ T细胞浸润并减少TME中T细胞耗竭。
• 伴随总T细胞群体增加，因为CD8+ T细胞在T细胞中的比例未因Tph1敲低而改变。
• Tph1敲低增强抗PD-1治疗的抗肿瘤疗效、延长生存，并增加IFN-γ+TNF-α+CD8+ T细胞频率。
• 在肝和肺转移模型中观察到类似效果，表明TPH1-5-HT轴在原发性 and 转移性肿瘤中广泛促进免疫抑制TME。

TPH1过表达实验：

• 在CMT167肿瘤中过表达TPH1：
  • 增加肿瘤间质液中5-HT水平。
  • 扩增免疫抑制性TAMs。
  • 增强CD8+ T细胞耗竭。
  • 损害抗PD-1治疗疗效。

• 总之，这些发现表明肿瘤来源5-HT驱动TAM介导的免疫抑制和对PD-1阻断的耐药。

  
  

结果6、遗传或药理学靶向HTR7增加PD-1阻断的抗肿瘤疗效

TAM特异性Htr7缺失（LysM^Cre;Htr7fl/fl小鼠）：

• 减少CD206+ TAMs的丰度和免疫抑制表型。
• 降低ARG1、IL-10和PD-L1表达。
• 增加CD8+ T细胞浸润，同时减少PD-1+CD8+ T细胞中TOX和TIM-3表达。
• 显著增强抗PD-1治疗的抗肿瘤疗效，并增加CD8+ T细胞细胞因子产生。

药理学HTR7抑制：

• HTR7抑制剂将TAMs重编程为较少抑制表型，增加功能性CD8+ T细胞，并与抗PD-1治疗协同实现优越的肿瘤控制。
• HTR7抑制还扩增肿瘤抗原特异性PD-1+TCF-1+祖细胞/干细胞样耗竭CD8+ T细胞，这是介导ICB响应的关键群体。

临床相关性：

• 在LCNEC中，治疗前高HTR7+免疫抑制性TAMs浸润与ICB基础化疗后显著更短的PFS相关。

• 这些发现识别HTR7+ TAMs作为ICB耐药驱动因素，支持HTR7靶向作为改善NEC中ICB疗效的策略。

  
  

结果7、靶向5-HT-HTR7轴克服NEC中对TCE治疗的耐药

小鼠DLL3×CD3 TCE的构建：

• 生成具有小鼠IgG1 Fc结构域的DLL3×CD3小鼠TCE。

体外共培养实验：

• RPP631细胞 + CD8+ T细胞 + TCE：TCE增加CD8+ T细胞IFN-γ和TNF-α产生，无论Tph1敲低与否，表明NEC来源5-HT不直接损害TCE介导的T细胞激活。
• 然而，加入M2-BMDMs后显著抑制细胞因子产生，而RPP631细胞中Tph1敲低消除了这种抑制效应。
• 外源性5-HT恢复了M2-BMDM介导的免疫抑制并降低CD8+ T细胞效应功能。
• 共培养RPP631细胞和M2-BMDMs显著增加PD-1+CD8+ T细胞中TIM-3和TOX表达。
• 荧光素酶杀伤实验显示，当与M2-BMDMs共培养时，RPP631细胞中Tph1敲低增加TCE处理的CD8+ T细胞杀伤能力。
• 使用LysM^Cre;Htr7fl/fl小鼠M2-BMDMs的共培养显示，Htr7缺失损害其抑制活性，增强TCE诱导的CD8+ T细胞细胞因子产生，并减少PD-1+CD8+ T细胞中TIM-3和TOX表达。

体内TCE实验：

• RPP631荷瘤小鼠接受TCE治疗：
  • 肿瘤细胞中Tph1敲低和TAMs中Htr7缺失均显著增强TCE的抗肿瘤活性，并增加TME中产生细胞因子的CD8+ T细胞。
• 药理学HTR7抑制与TCE协同，导致更大的CD8+ T细胞活化和优于任一单药的肿瘤控制。

临床关联：

• SCLC患者中，非应答者（进展性疾病）的治疗前肿瘤含有显著更高水平的HTR7+ TAMs，相比应答者（非进展性疾病）。
• HTR7+ TAM浸润增加与tarlatamab治疗后更短的PFS相关。

三联组合实验：

• 为模拟tarlatamab + ICB的临床开发，评估HTR7抑制是否能增强该联合治疗疗效。
• 在RPP631荷瘤小鼠中，PD-1阻断 + TCE + HTR7抑制剂实现更高的完全肿瘤根除率（66.7%，8/12），相比PD-1阻断+TCE（8.3%，1/12）或PD-1阻断单药（0%，0/12）。

• 总之，NEC来源5-HT激活HTR7+ TAMs驱动CD8+ T细胞终末耗竭和对TCE及ICB的耐药，而阻断5-HT-HTR7轴显著增强TCE基础免疫治疗（包括与ICB联合）的疗效。

  
  

讨论

主要贡献

• 神经递质越来越被认为是抗肿瘤免疫的重要调节因子。低5-HT浓度据报道增强CD8+ T细胞增殖和效应功能，而较高浓度驱动HTR7依赖性免疫抑制性巨噬细胞诱导。
• 在DLL3^high NECs的5-HT丰富微环境中，TAM介导的免疫抑制优先于直接T细胞激活，从而将平衡从免疫监视转向免疫耐受。
• 这些发现突出神经递质信号在塑造神经内分泌恶性肿瘤免疫反应中先前未被充分认识的作用，并为ASCL1^high NECs（ largely 对免疫治疗耐药的亚型）的免疫抑制表型提供机制解释。
• 此外，研究表明DLL3具有超出其治疗靶点作用的生物学后果；虽然更高DLL3表达应增强DLL3×CD3导向TCE疗效，但其与免疫抑制TME的关联可能限制有效抗肿瘤免疫。这种双重作用可能有助于解释DLL3表达与DLL3导向治疗临床活性的解耦，支持同时靶向肿瘤细胞和免疫抑制TME的组合策略。

耐药机制

• 很少有报道描述DLL3×CD3导向TCE的耐药机制。神经内分泌表型可塑性或循环肿瘤细胞中DLL3表达丢失代表TCE耐药机制，这些是肿瘤细胞内在耐药机制。
• 相反，TME介导的耐药 largely 未探索。本研究识别出一种TME介导的耐药机制，特征为TAM的5-HT-HTR7依赖性免疫抑制活性。
• 临床前研究显示HTR7药理学抑制恢复TCE和ICB的抗肿瘤疗效。此外，模拟ICB和TCE临床试验，在动物模型中向该方案加入HTR7抑制剂实现远强于ICB+TCE联合的抗肿瘤效果，支持这种三联组合治疗的临床应用。
• 因此，靶向5-HT-HTR7轴可能是克服肺NECs中DLL3导向TCE耐药的免疫介导成分的合理策略。

"神经-免疫基因组癌症进化"概念

• 由于癌基因异常频繁具有免疫调节效应，常导致癌症免疫治疗耐药，作者提出"免疫基因组癌症进化"概念，即癌细胞中的基因组异常在癌症进化过程中塑造免疫抑制TME。
• 本研究发现具有DLL3扩增的NECs通过5-HT-HTR7轴激活免疫抑制性TAMs，从而将"免疫基因组癌症进化"概念扩展为"神经-免疫基因组癌症进化"：NECs获得决定神经递质的基因改变并激活免疫抑制细胞，导致癌症进化过程中的免疫逃逸。
• 这一概念可能将肿瘤基因组进化、神经内分泌谱系程序、神经递质代谢和免疫逃逸整合到理解肺NEC治疗耐药的统一框架中。

局限性

1. 体内SCLC实验主要依赖RPP631，因为同基因小鼠SCLC/NEC模型稀缺。虽然TPH1过表达CMT167细胞支持5-HT-TAM介导的免疫抑制，但需要额外的鼠和患者来源异种移植模型。
2. 治疗前样本占主导，无法评估治疗诱导的DLL3表达和谱系状态变化。
3. DLL3×CD3 TCE + HTR7抑制未在包含TAMs和T细胞的患者来源模型中测试，值得未来转化评估。

结论

• 揭示了一个未被充分认识的机制：DLL3驱动TPH1表达和5-HT产生，随后激活HTR7+免疫抑制性TAMs，损害CD8+ T细胞活性并赋予TCE和ICB耐药。
• 该轴为DLL3^high NECs患者为何不能从DLL3导向TCEs获益的临床悖论提供机制见解。
• 提出"神经-免疫基因组精准医学"范式，其中癌症免疫治疗（包括TCEs）通过与调节NEC特异性免疫抑制TME的神经分子靶向试剂整合来优化。

生活很好，有你更好。