Nat Biomed Eng | PD-L1和CD3ε双特异性抗体重新活化肿瘤特异性CD8 T细胞

原创 huacishu 图灵基因 今天

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：huacishu

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亮点：

1、作者构建了靶向免疫检验点PD-L1 和CD3ε的双特异性抗体（PD-L1xCD3）；

2、该研究表明，靶向CD3ε和树突状细胞上的免疫检验点PD-L1的双特异性抗体，能够重新活化肿瘤特异性CD8 T细胞，诱导持续性抗肿瘤免疫反应。

美国德克萨斯大学西南医学中心傅阳心教授团队在国际知名期刊Nat Biomed Eng在线发表题为“Rejuvenation of tumour-specific T cells through bispecific antibodies targeting PD-L1 on dendritic cells”的论文。双特异性T细胞衔接器（BiTEs）优先以肿瘤相关抗原为靶点，并刺激CD3介导的信号传导，用于治疗急性B细胞淋巴母细胞白血病。然而，实体肿瘤BiTEs的效力受到其短半衰期和在相关治疗剂量下的严重毒性的限制。在此，作者报告了同时针对小鼠T细胞受体CD3ε和小鼠免疫检查点程序性死亡配体1（PD-L1）的双特异性抗体的设计和体内性能。在多个基因肿瘤模型中，双特异性抗体产生的抗肿瘤免疫应答高于靶向肿瘤相关抗原和CD3ε的传统BiTEs。作者发现持久的抗原特异性T细胞反应是CD8 T细胞再生的结果，这是由于PD-L1对树突状细胞的阻断以及B7-1和B7-2（树突状细胞上的外周膜蛋白）的共同刺激。以树突状细胞而非肿瘤细胞为靶点的双特异性T细胞衔接器可能是T细胞再生用于持久癌症免疫治疗的一般方法。

为了评估PD-L1靶向T细胞衔接器的抗肿瘤效果，作者制备了两种不同的双特异性抗体。一个靶向EGFR和小鼠CD3ε，而另一个靶向PD-L1和小鼠CD3ε。两种抗体都由两个单链可变片段和一个延长体内蛋白质半衰期的人类IgG的Fc结构域组成。抗体的CH3结构域形成异二聚体，CH2结构域通过“LALA-PG”突变体减少Fcγ受体（FcγR）结合（图1a）。首先通过凝胶电泳确认了双特异性抗体的纯度和分子量。然后，使用色谱法确认纯化蛋白中的聚集物和片段少于0.5%，内毒素水平低于0.02EUml−1.为了比较每种双特异性抗体的结合亲和力和治疗效果，从小鼠结直肠癌细胞系MC38中获得了一个靶细胞系。该细胞系被称为MC38E5，表达一种嵌合的小鼠EGFR，该小鼠EGFR含有六种氨基酸，经突变后可与EGFR抗体西妥昔单抗结合。PD-L1-靶向BsAb（PD-L1×CD3）可特异性结合PD-L1+肿瘤细胞，而EGFR-靶向BsAb（Erb×CD3）优先结合EGFR+肿瘤细胞（图1b）。此外，这两种抗体在CD8 T细胞上与CD3ε具有相似的亲和力（图1b）。Fc结构域在双特异性抗体功能中起多种作用。一方面，它延长了体内半衰期；另一方面，它也非特异性地连接CD3复合体。作者观察到抗体依赖性细胞毒性也降低而不是增加脾脏中的T细胞百分比。因此，重新设计了Fc结构域，以保持新生儿Fc受体结合亲和力，但降低FcγR结合亲和力。具有野生型CH2结构域的抗体可与FcγR+小鼠巨噬细胞系结合。相比之下，具有该重组突变体CH2结构域的抗体表现出降低的结合亲和力，这类似于使用抗CD16/CD32阻断FcγR结合（图1c）。接下来测试了双特异性抗体是否能激活T细胞以杀死肿瘤细胞。当抗体应用于共同培养的肿瘤细胞和CD8 T细胞时，T细胞迅速上调细胞表面CD25和CD69的表达，并以剂量依赖性方式增加IFN-γ的分泌（图1d，e）。同时，肿瘤细胞也被有效地杀死，表明T细胞功能完全激活（图1f）。与Erb×CD3相比，尽管Erb×CD3和PD-L1×CD3在T细胞活化标记物中具有相似的最大有效浓度（EC50）和在肿瘤细胞中具有相似的最大抑制浓度（IC50），PD-L1×CD3对IFN-γ的杀伤作用更强。此外，当PD-L1在肿瘤细胞上被敲除时，PD-L1×CD3完全失去激活T细胞的能力（图1g，h）。这些结果表明，PD-L1×CD3在体外能够激活T细胞，以PD-L1依赖的方式杀伤肿瘤细胞。

由于PD-L1×CD3在体外产生有效的抗肿瘤作用，接下来研究它是否也能在基因小鼠模型中诱导抗肿瘤免疫反应。当PD-L1×CD3经腹腔注射给MC38荷瘤小鼠时，肿瘤在第二次输注后被完全根除。尽管抗CD3对CD3信号的非特异性参与在早期显示出与PD-L1×CD3相似的抗肿瘤作用，但经治疗的肿瘤在第二次输注后最终复发。与PD-L1×CD3相比，抗PD-L1或抗PD-L1+抗CD3联合治疗均不能产生类似的抗肿瘤效果，表明PD-L1×CD3的抗肿瘤效果不是由于同时刺激CD3信号和阻断检查点的协同效应（图2a）。此外，与联合治疗相比，PD-L1×CD3治疗显著提高了总生存率（图2b）。更重要的是，PD-L1×CD3治疗也在MC38OVA荷瘤小鼠的脾脏中诱导了OT-I特异性IFN-γ产生，进一步证明了抗原特异性T细胞应答的有效产生（图2c，d）。记忆性T细胞反应在建立针对癌症的保护性免疫中起着关键作用，但BiTEs诱导免疫记忆的能力尚未在体内得到证实。然而，在治疗后第50天再次挑战PD-L1×CD3治愈的小鼠，使其肿瘤细胞数量增加10倍时，没有肿瘤能够生长出来，这表明PD-L1×CD3治疗在根除肿瘤后有效地产生记忆免疫反应（图2e）。为了进一步证明PD-L1×CD3治疗产生记忆性T细胞，将治愈小鼠的脾细胞过继转移至Rag1−/−老鼠。转移的脾细胞不仅阻止了肿瘤的发生（图2f），而且在体内有效地排斥了已建立的肿瘤（图2g）。综上所述，PD-L1×CD3可能向T细胞提供不同的信号，引发针对肿瘤的特异性免疫反应。

接下来，研究了PD-L1×CD3治疗效果的潜在机制。PD-L1×CD3对携带MC38的Rag1–/–小鼠没有影响，这证实了适应性免疫对于PD-L1×CD3的治疗效果至关重要（图3a）。此外，用抗CD4或抗CD8消耗不同的T细胞亚群证实了CD8 T细胞，而不是CD4 T细胞，有助于治疗效果（图3b）。为了进一步确定PD-L1×CD3治疗是否依赖于肿瘤微环境中预先存在的T细胞或外周组织中T细胞的募集，在PD-L1×CD3治疗期间使用FTY720（S1P受体激动剂）阻断T细胞向肿瘤组织的转运。FTY720阻断不会影响PD-L1×CD3的治疗效果，表明TME中预先存在的CD8 T细胞在该治疗中的作用足够大（图3c）。为了进一步阐明PD-L1×CD3是否靶向肿瘤组织以诱导抗肿瘤作用，用BsAb对小鼠进行肿瘤内治疗。正如预期的那样，与全身治疗相比，局部治疗也足以达到类似的抗肿瘤效果。作者还测试了治疗后不同时间点双特异性抗体的体内分布。从腹腔注射后24小时开始，抗体优先在肿瘤组织中富集，可检测水平持续5天。因此，PD-L1×CD3可以靶向肿瘤组织以恢复CD8 T细胞免疫。除了CD8 T细胞外，许多其他类型的免疫细胞在TME中富集以响应治疗。尽管它们不是肿瘤杀伤的主要效应细胞，但它们仍可能通过与CD8 T细胞相互作用发挥重要作用。为了确定治疗期间有助于抗肿瘤作用的关键成分，进行了一系列消耗实验。抗NK1.1的NK细胞耗竭或抗CSF1R的巨噬细胞耗竭不影响PD-L1×CD3对肿瘤生长的控制（图3d）。由于PD-L1×CD3与Erb×CD3相比的独特性主要通过参与CD3复合物结合的靶点（PD-L1与EGFR）存在，作者提出肿瘤微环境中的PD-L1+细胞可能有助于CD8依赖性抗肿瘤免疫。

PD-L1在多种组织中广泛表达，包括淋巴细胞、髓样细胞和肿瘤细胞。为了阐明PD-L1对不同细胞在PD-L1×CD3治疗中的作用，作者进行了多基因敲除（KO）研究。首先测试了PD-L1×CD3对PD-L1 KO肿瘤的治疗效果。令人惊讶的是，PD-L1×CD3在患有PD-L1 KO MC38（图4a）或B16（图4a）肿瘤的小鼠中仍然产生有效的抗肿瘤反应。然而，其治疗效果在携带WT MC38的PD-L1缺陷小鼠中被完全消除，这表明PD-L1对宿主细胞而不是肿瘤细胞在PD-L1×CD3的抗肿瘤作用中起着关键作用（图4b）。由于骨髓细胞是肿瘤微环境中PD-L1+的主要宿主细胞，接下来使用条件KO小鼠研究哪些PD-L1表达细胞对PD-L1×CD3的抗肿瘤作用至关重要。研究结果表明，PD-L1×CD3能够控制Lyz2CrePD-L1f/f小鼠（巨噬细胞特异性PD-L1基因敲除）的肿瘤生长，但在Zbtb46CrePD-L1f/f小鼠（树突状细胞特异性PD-L1基因敲除）中不能。这表明PD-L1×CD3治疗需要树突状细胞上的PD-L1，而不是巨噬细胞上的PD-L1（图4c）。作者测量了PD-L1在肿瘤不同细胞上的表达水平。DC，尤其是CD103+DC，在体内表达最高水平的PD-L1，这可能有助于PD-L1×CD3的DC靶向性。这些结果表明，作者的治疗可能通过DC的独特子集改善CD8 T细胞功能（图4d）。综上所述，CD103+cDC1上的PD-L1在促进PD-L1×CD3治疗的抗肿瘤效果方面起着关键作用。

与Erb×CD3相比，PD-L1×CD3靶向DC上的PD-L1以促进更好的免疫反应，因此进一步研究了TME如何重塑以促进CD8 T细胞反应。在治疗后48小时，通过流式细胞术分析脾脏和肿瘤中的淋巴细胞和髓样细胞群。在PD-L1×CD3治疗组中，肿瘤中CD8 T细胞、CD4 T细胞和NKT细胞的百分比显著增加，但在Erb×CD3治疗组中没有增加。相反，NK细胞和B细胞的百分比保持不变。进一步分析了肿瘤中CD8 T细胞的免疫表型，因为它们在治疗过程中起着至关重要的作用。PD-L1×CD3处理不仅增加了CD69，还增加了CD8 T细胞上Ki-67的表达，表明CD8 T细胞在处理后被激活和扩增（图5a）。治疗后，PD-1和TIM-3双阳性终末衰竭CD8 T细胞的百分比显著降低（图5a）。同时，TCF1+和CD28+干细胞样CD8 T细胞的百分比增加（图5b），表明PD-L1×CD3治疗改变了肿瘤内CD8 T细胞的表型。更重要的是，PD-L1×CD3治疗后，肿瘤中抗原特异性CD8 T细胞的百分比也增加（图5b）。因此，PD-L1×CD3可能优先激活CD8 T细胞的“DC相互作用”群体，以建立特异性抗肿瘤免疫。此外，还检测了TME中髓样细胞的动力学。巨噬细胞和骨髓间充质干细胞的百分比在治疗后显著降低，因为它们被视为“PD-L1+靶点”（图5c）。同时，尽管树突状细胞在启动抗肿瘤作用中起着关键作用，但树突状细胞的百分比也降低了（图5c）。值得注意的是，尽管总CD4 T细胞百分比增加，但Treg的百分比也降低。尽管其机制尚不清楚，但已有报道PD-L1在Tregs上的表达，这可能是这种现象的一种解释。当观察到肿瘤组织中髓细胞百分比显著降低时，进一步研究了这些变化对免疫反应的影响。首先，治疗后淋巴结和脾脏中巨噬细胞、骨髓间充质干细胞和树突状细胞的百分比保持不变（图5c）。其次，进行了调查使用PD-L1基因敲除小鼠，肿瘤组织中髓样细胞的动态变化如何调节抗肿瘤免疫。当从巨噬细胞中敲除PD-L1时，PD-L1×CD3仍能产生有效的抗肿瘤反应（图4c）。然而，巨噬细胞和骨髓间充质干细胞的百分比保持不变。巨噬细胞的减少可能有助于启动T细胞活化，但这还不够，因为PD-L1×CD3治疗也降低了Zbtb46CrePD-L1f/f小鼠中巨噬细胞的百分比，但未观察到抗肿瘤作用（图4c）。总之，PD-L1×CD3重塑TME以激发特异性抗肿瘤免疫。

产生保护性T细胞免疫是癌症免疫治疗中最理想的目标之一。然而它仍然是当前肿瘤细胞靶向治疗的主要障碍。数据表明，PD-L1×CD3可以靶向DC以促进抗原特异性T细胞免疫。因此，进一步研究了参与这一过程的潜在机制。先前的研究表明，抗PD-1治疗的疗效依赖于CD28，这突出了共刺激信号在产生和维持T细胞免疫中的重要性。因此，假设PD-L1×CD3的治疗效果可能依赖于T细胞的共同刺激。为了验证这一假设，将抗CD80/86抗体与PD-L1×CD3治疗相结合（图6a）。阻断B7-CD28共刺激完全消除了PD-L1×CD3的治疗效果（图6a）。当使用CTLA4-Ig（一种竞争性结合CD80/86以阻断其信号传导的融合蛋白）时，也观察到类似的结果。阻断B7-CD28相互作用也抑制了肿瘤中抗原特异性T细胞的生成（图6a）。为了进一步确定共刺激信号如何帮助DC在PD-L1×CD3存在的情况下产生适当的T细胞反应，在Erb×CD3或PD-L1×CD3存在的情况下，将肿瘤细胞或脾脏DC与CD8 T细胞共同培养。PD-L1×CD3，而不是Erb×CD3，在肿瘤-T细胞和DC-T细胞共培养的上清液中诱导T细胞上CD25+CD69+和IFN-γ的表达水平相似（图6b，c）。然而令人惊讶的是，肿瘤-T细胞组的活T细胞百分比远低于DC-T细胞组。AICD发生在经Erb×CD3或PD-L1×CD3处理的肿瘤细胞活化T细胞中，但在经PD-L1×CD3处理的树突状细胞活化T细胞中显著减少（图6d）。因此，靶向肿瘤细胞以重新激活T细胞可能仅具有短暂的抗肿瘤作用，并且由于缺乏共刺激、T细胞死亡增加和无记忆反应而不能产生持久的作用。体内数据还显示，与对照组相比，Erb×CD3治疗组肿瘤内CD8 T细胞的频率较低，这与体外结果一致。此外，当在DC-T细胞共培养物中与PD-L1×CD3一起施用抗CD80/86阻断抗体时，T细胞活化降低，T细胞凋亡增加至与肿瘤-T细胞共培养物相似的水平（图6b，d）。这进一步证实PD-L1×CD3治疗通过增强CD28共刺激促进T细胞存活。当通过流式细胞仪检测上清液中的细胞因子时，观察到DC-T细胞共培养诱导最高水平的IL-2。然而，在Erb×CD3组中未检测到IL-2。正如预期的那样，IL-2的产生也依赖于B7-CD28（图6e）。最后，当分析癌症基因组图谱（TCGA）数据库时，具有高水平CD28表达但不具有CD8 T细胞浸润的患者具有更好的累积生存率（图6f，g）。树突状细胞浸润和CD80/86表达水平与CD28水平显著相关，表明树突状细胞介导的T细胞共刺激在抗肿瘤免疫中的潜在重要性。总之，PD-L1×CD3靶向树突状细胞，以B7-CD28依赖的方式激活抗原特异性T细胞，并克服了传统疗法的主要障碍（图7）。

双特异性T细胞接合器在实体肿瘤中的应用可能不仅受到免疫抑制性TME的阻碍，而且还受到缺乏合适靶点的限制。在此，设计并评估了PD-L1靶向双特异性抗体在基因小鼠模型中的有效性和安全性。与传统的治疗相比，PD-L1×CD3治疗靶向并重新激活体内已有的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），这可以充分根除肿瘤并建立保护性免疫。从机制上讲，用PD-L1×CD3靶向树突状细胞亚群而不是肿瘤细胞不仅可以增强B7-CD28相互作用，而且可以同时阻断PD-1/PD-L1检查点，以建立适当的抗原特异性CD8 T细胞反应来控制肿瘤进展。综上所述，研究强调了Batf3+DC代替肿瘤细胞在PD-L1靶向双特异性抗体治疗中不可或缺的作用，从而恢复和维持对癌症的持久免疫应答。

教授介绍

傅阳心教授在中国上海医科大学学习医学，并获得博士学位，2015年就职于德克萨斯大学西南医学中心病理区，他的研究领域主要是癌症的免疫治疗，他发现60%的病例免疫治疗失败是因为肿瘤内部没有足够的免疫细胞。免疫疗法可以加速免疫系统，但杀伤细胞仍然无法进入肿瘤内部对癌症造成伤害。傅博士的团队一直在开发新的方法，通过使用一种生物学上的诱饵，将T细胞引导到它们需要去的地方。一旦T细胞进入肿瘤内，免疫治疗应该能够对所有类型的癌症更有效。并且傅阳心教授以通讯作者在国际权威期刊上发表论文多篇。

参考文献

Liu L, Chen J, Bae J, et al. Rejuvenation of tumour-specific T cellsthrough bispecific antibodies targeting PD-L1 on dendritic cells. Nat BiomedEng. 2021;10.1038/s41551-021-00800-2. doi:10.1038/s41551-021-00800-2