影响因子： 5.7
研究概述：
慢性阻塞性肺病（COPD）是最普遍的慢性呼吸系统疾病之一，中性粒细胞炎症在慢性阻塞性肺病的发生和发展中起着至关重要的作用。该研究旨在通过生物信息学预测和实验验证，鉴定参与COPD中性粒细胞炎症的新型枢纽基因。作者分析单细胞RNA测序结果后发现，COPD样本中上调的基因集与NF-κB信号通路的中性粒细胞炎症反应和TNF-α激活有关。免疫浸润分析结果显示COPD肺组织中中性粒细胞上调。作者结合了来自差异和模块化基因的数据，确定了51个与中性粒细胞炎症相关的差异基因。使用孟德尔随机化分析，探索了6个与COPD有因果关系的基因。同时，通过PPI网络分析鉴定出11个枢纽基因，RNA-seq结果显示，以上11个基因的表达均处于上调状态。qPCR实验验证了COPD患者外周血白细胞中11个基因中的9个。此外，5个基因与COPD患者的肺功能呈负相关。最后，作者构建了NAMPT和PTGS2两个更为关键的基因-转录因子网络。这两个基因可作为COPD临床严重程度的潜在生物标志物。
关于非肿瘤生信，我们也解读过很多，主要有以下类型
1 单个疾病WGCNA+PPI分析筛选hub基因
2 单个疾病结合免疫浸润，热点基因集，机器学习算法等
3 两种相关疾病联合分析，包括非肿瘤结合非肿瘤，非肿瘤结合肿瘤或者非肿瘤结合泛癌分析
4 基于分型的非肿瘤生信分析
5 单细胞结合普通转录组生信分析
目前非肿瘤生信发文的门槛较低
研究流程图：
研究结果：
基于单细胞数据的基因集富集分析
作者从GSE173896数据集中获得4个COPD和3个对照非吸烟者的scRNA-seq 肺组织样本，对其进行质量控制后，根据特征基因的表达水平，将所有细胞分为16个簇，并依据标记基因注释为14种细胞类型。随后作者根据从MsigDB数据库收集的标志性基因集，使用irGSEA包来计算每个细胞的基因集富集分数。差异分析后发现，COPD样本中有两个标志性基因集上调：INFLAMMATORY-RESPONSE和TNFA-SIGNALING-VIA-NFKB。同时，对照样品的两个基因集显著下调（图3A）。接下来，对不同类型的细胞进行相同的操作，发现这两个基因集在中性粒细胞和DC中均上调（图3B）。小提琴图和UMAP图均显示NFLAMMATORY_RESPONSE基因集在中性粒细胞中显著富集（图3C和图3D）。
单细胞数据集中性粒细胞的富集分析和伪时间分析
中性粒细胞炎症在慢性阻塞性肺病的发病机制中占主导地位。作者采用FindMarkers方法鉴定了患者和对照组中的中性粒细胞差异表达基因，富集结果表明差异基因集中于炎症和免疫反应相关的生物过程（补充图）。因此，作者对所有中性粒细胞的细胞轨迹分化进行了模拟分析。结果表明，蓝色越深，细胞分化越早，表明中性粒细胞随着时间的分化从左向右分化，最新分化的细胞以最浅的蓝色表示（图4A）。用不同颜色标记的中性粒细胞有三种分化状态，左边的红色是最早的分化类型（图4B）。作者分别研究了COPD和对照组中中性粒细胞的分化过程，结果显示COPD中性粒细胞分化较晚，而对照中性粒细胞分化较早（图4C）。在不同分化状态的中性粒细胞中进行GSEA研究假时间与基因功能之间的关系，结果显示最新分化的中性粒细胞主要与炎症和免疫反应的上调有关（图4E-G）。
RNA-seq数据的免疫浸润分析
接着，作者利用RNA测序数据，通过CIBERSORT算法计算每个样品中的细胞类型比例，不同的颜色代表不同的免疫细胞（图5A）。在COPD样本和正常样本中，中性粒细胞、M2型巨噬细胞、静息NK细胞和T滤泡辅助细胞等4种免疫细胞的比例存在差异。此外，COPD样本中中性粒细胞的比例显着增加（图5B）。在图5C中，相关性热图表明，中性粒细胞与树突状细胞，CD8 T细胞，T滤泡辅助细胞，NK细胞激活和M2型巨噬细胞呈负相关。相反，中性粒细胞与三种细胞呈正相关，包括树突状细胞、单核细胞和激活的肥大细胞。
筛选与中性粒细胞相关的差异基因
作者对转录测序数据的基因表达矩阵进行了WGCNA分析，这些基因根据其相似的共表达特征被聚类为12个模块（图6C）。模块和性状（中性粒细胞和COPD）的相关性分析表明，MEorangered4和MElightssteelblue1与中性粒细胞显著相关（图6D）。因此，选择orangered4模块和lightssteelblue1模块中的基因作为与中性粒细胞相关的必需基因进行进一步分析。转录组学差异分析显示，在 COPD 和正常样本之间鉴定出 827 个 DEG，包括 390 个上调基因和 437 个下调基因。韦恩图显示在已获得的scRNA-seq DEGs、RNA-seq DEGs 和WGCNA相关性模块基因的交集中共有33个上调和18个下调的特征基因均显著性差异表达（图7A, D）。KEGG通路分析显示，上调的DEGs主要富集于IL-17信号通路、NF-κB信号通路和TNF信号通路。同时，下调的DEGs主要富集于氧化和收集导管酸分泌中。GO分析表明，上调的DEGs富含平滑肌增殖、分泌和细胞因子活性。下调的DEGs在金属离子、晚期内体和质子跨膜转运蛋白活性的作用下富集。
特征DEGs与COPD之间的孟德尔分析
MR分析用于探究特征DEGs与COPD之间的关系，以验证其关系是因果关系还是相关性。IVW分析显示，NAMPT、PTGS2、SLC2A3和TRIB1水平与COPD风险增加相关，而CDKN1A和CSRNP1与COPD风险降低相关。Cochran's Q 检验显示这些基因结果没有异质性。MR-Egger回归分析表明，这些基因的结果中没有水平多效性（表2）。
枢纽基因的PPI网络分析与鉴定
对筛选出的51个特征基因，作者构建了PPI网络，Cytoscape 中可视化后结果显示，互作网络包含 25 个节点和 47 条边缘。此外，作者利用 cytoHubba 插件，通过最大集团中心性算法搜索最重要的枢纽基因（图 8B）， 鉴定出排名前10位的枢纽基因，包括IL1B、CXCL2、PTGS2、MCL1、SOD2、EGR1、CDKN1A、CXCL3、NAMPT、TNFAIP3和ZFP36，NAMPT和MCL1均排名第10位。以上11个枢纽基因均为上调基因。相关性分析显示，这些枢纽基因与各种免疫细胞具有相关性，并且它们都与中性粒细胞显著正相关（均为P<0.05）（图8C-M）。
枢纽基因的验证
由于中性粒细胞约占外周血中所有白细胞的 70%，因此作者从血液样本中分离出外周血白细胞，对白细胞进行qPCR验证枢纽基因。作者共收集了27 名 COPD 患者和 27 名健康个体的外周血样本。qPCR结果显示，与正常受试者相比，COPD患者的IL1B、CXCL2、PTGS2、MCL1、SOD2、EGR1、NAMPT、CXCL3和ZFP36的mRNA水平显著升高（图9）。此外，相关性分析显示，IL1B、CXCL2、SOD2、NAMPT和CXCL3与COPD患者的肺功能呈负相关（图10）。 最后，作者根据孟德尔随机化鉴定的6个相关性基因和COPD患者外周血白细胞中升高的9个基因的交叉点确定了两个更为关键的基因NAMPT 和 PTGS2（图 11A），并构建了基于这两个基因的转录因子网络图，筛选出与COPD有关的转录因子。
研究总结：
中性粒细胞炎症在慢性阻塞性肺病的病理生理学中起着核心作用，并在整个疾病过程中持续存在，但其作用的靶点仍然相对稀缺，这使得中性粒细胞炎症的新生物标志物的鉴定对于开发有效的慢性阻塞性肺病治疗方案至关重要。作者基于此通过分析COPD和对照肺组织样本中的scRNA-seq和RNA-seq数据，鉴定出9个与中性粒细胞炎症相关的枢纽基因，其中5个基因与COPD患者肺功能呈负相关。通过孟德尔随机化分析进一步确认NAMPT和PTGS2是COPD的危险因素，为COPD中性粒细胞炎症和肺功能的检测提供了新的方法。这是非肿瘤疾病生信分析中的典型思路，从通路筛选到鉴定出与疾病相关的特征基因，随后以可获得的临床样本进行验证。
