1.两大难题
- 要高扩增且均一覆盖
一个人类细胞总RNA大约只有10pg左右，mRNA大约只有0.2pg，要获得零点几微克的核酸文库，扩增量需几百万倍以上，而PCR扩增过程中会产生扩增偏差（PCR偏差），即一部分DNA片段被大量扩增，从而导致高通量测序只能测到很少一部分的片段序列 - 要高效得到mRNA测序文库
rRNA在总RNA中占了95%以上
mRNA在总RNA中只占了2-3%
2.建库方法
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Clontech公司 SMART法
定位引物 利用mRNA3’末端的polyA设计引物，使引物不会结合到mRNA的别的地方，保证逆转录起始位置是mRNA3’序列终止位置
MMLV逆转录酶 会在新合成的cDNA3’末端多加出几个C碱基，上游引物3'末端会有几个非脱氧的G碱基，保证合成的双链cDNA是全长的cDNA
MMLV逆转录酶继续发挥聚合作用形成双链cDNA，cDNA两端都已经接好了设计好的统一普通PCR引物，保证了PCR扩增效率的一致性，减少了PCR偏差
然后可以加入常规引物进行常规PCR扩增，建库测序
PCR扩增后测序准确性结果 EpiCentre公司 TargetAmp法
T7-Oligo（dT）引物：5'为T7启动子、3'为polyT与mRNA3'端polyA结合
RNnse酶消化掉杂交双链中的RNA链
然后合成双链cDNA作为转录模版
利用T7启动子转录出大量的反义RNA（aRNA）
纯化aRNA利用随机引物合成第二轮的cDNA
再经过一轮的转录和逆转录可以得到几个ug的cDNA，然后可以用来建库测序
亮点：
- 利用T7统一的启动子，保证转录启始效率
- 利用反复转录和逆转录扩增得到cDNA文库，避免了PCR扩增的效率偏差
