一、illumina测序原理
illumina的底层原理就是基于可逆终止的、荧光标记dNTP来做边合成变测序的工作。
工作流程主要有四个步骤：
- 样本准备（文库构建）：
将DNA片段化，就是将基因组DNA用超声波打断，然后用酶将两端补平，接着在3‘端加上一个A碱基；
在3’端将带有dA尾的DNA片段与adapter进行连接，连接好的DNA混合物就是文库（library），接头包含了index和测序结合片段。 - 簇生成（就是一个扩增的过程）
lane表面会通过共价键接上一些寡聚核苷酸引物，用来与测序结合片段结合。
将文库接到flowcell上，文库会和lane表面的寡聚核苷酸引物结合进行pcr，pcr完成后加入氢氧化钠碱溶液将一条链冲洗下去。
加入中性溶液，将lane表面复制完成的链与lane表面的另一端寡聚核苷酸引物结合，进行桥式pcr。重复这一过程，知道有足够的簇。然后通过切除基团的方式去除反向链。
ps：
Flowcell ：流动池，就是一张芯片，如Hiseq2500有2张flowcell，即一次运行的测序量；
Lane：每张flowcell上通常都有多个通道，每个通道可以单独测不同的样品。 - 测序
通过3‘端的叠氮基团来暂时终止合成，通过荧光基团来识别碱基。然后通过化学试剂切除叠氮基团和荧光基团，即可逆终止，边合成边测序。
在第一次读段结束后，进行index的读取，每个样本都有特定的接头，每个接头都有特定的序列，即index。index读取是为了识别样本的来源，需要先洗去读段产物，然后加入index1的测序引物，进行第二轮测序，一般是六到八个碱基。
如果是双端测序，接下来就需要进行反向测序，先加入index2的引物进行测序，通过聚合酶完成桥式pcr的扩增，洗脱后留下反向链进行测序，得到read2序列。 - 分析数据
连续序列与参考基因组进行比对，来进行突变识别。
Illumina测序原理详解
二、测序相关
常用数据格式.png
测序历史.png
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