本文选自2021年的nature，喜欢的可以自行下载阅读，这个难度你感受一下
摘要：铁死亡是一种铁依赖的非凋亡细胞死亡过程，与各种退行性疾病有关，并代表某些癌症的靶向易感性。易患铁死亡的细胞状态可以预先存在于由某些谱系产生的细胞中，也可以在细胞状态转变过程中获得。然而，对铁死亡的敏感性是如何被动态调节的仍然知之甚少。在这里，我们使用全基因组CRISPR-Cas9抑制剂筛选来鉴定过氧化物酶体氧化细胞器，作为人类肾和卵巢癌细胞铁死亡敏感性的关键因素。利用脂质组学图谱，我们表明过氧化物酶体通过合成多不饱和醚磷脂(PUFA-ePLS)促进铁死亡，多不饱和醚磷脂作为脂质过氧化的底物，反过来导致铁死亡的诱导。在小鼠体内，最初对铁死亡敏感的癌细胞可以转变为抗铁死亡状态，这与PUFA-ePLS的广泛下调有关。我们进一步发现，PUFA-ePLS的促铁死亡作用可以扩展到肿瘤细胞以外的其他细胞类型，包括神经元和心肌细胞。总之，我们的工作揭示了过氧化物酶体-醚-磷脂轴在驱动铁死亡易感性和逃避铁死亡中的作用，强调了PUFA-ePLS是一种独特的功能性脂质类，在细胞状态转变过程中受到动态调节，并建议对涉及铁死亡的疾病进行治疗干预的多个调节节点。
铁死亡敏感性动态调节的分子和代谢基础知之甚少。为了确定调节铁死亡易感性的因素，我们在铁死亡易感性透明细胞肾细胞癌(ccRCC)模型786-O3和高级浆液性卵巢癌模型OVCAR-8中进行了两个独立的全基因组CRISPR-Cas9抑制筛选(图1a)。在这两种模型中，通过使用ML210或1S，3R-RSL3抑制脂质过氧化修复酶谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)来诱导铁死亡(补充视频1)。两个筛选都揭示了已知的铁死亡调节因子——包括酰基辅酶a合成酶长链家族成员4(ACSL4)8(图1b，扩展数据图1a，b，补充数据1)——证实了我们的筛选在识别铁死亡敏感性介质方面的稳健性。在以前未被特征化的亲铁基因中，过氧化物酶体成分作为最丰富的基因簇出现，使用了STRING(蛋白质网络数据库9)和我们开发的路径分析算法，命名为基因列表网络富集分析(GeLiNEA)(扩展数据图1a-e，补充数据2)。在两个筛选中鉴定的过氧化物酶体基因包括过氧化物酶体生物发生基因PEX10和PEX3，以及编码过氧化物酶体酶体烷基甘油酮磷酸合酶(AGPS)和脂肪酰基辅酶a还原酶1(FAR1)12的基因；其他过氧化物酶体基因——包括甘油磷酸酰基转移酶(GNPAT)、PEX12和PEX7——在每个单独的时间点都显著富集(图1b，扩展数据图1a，b，f，g)。
因为过氧化物酶体以前并未涉及铁死亡，我们着重阐明了它们在这一过程中的可能作用。我们发现使用CRISPR-Cas9在OVCAR-8和786-O细胞中消除编码PEX3、PEX10和PEX12的基因降低了过氧化物酶体的丰度，并降低了细胞对GPX4抑制诱导的铁死亡的敏感性(图1c，扩展数据图2a-d)。相反，小鼠Pex3或Pex10cDNAs的实验性过表达对相应的人单导向RNAs(sgRNAs)的失活具有抗性，恢复了对铁死亡的敏感性(扩展数据图2e，f)，支持过氧化物酶体作为肾和卵巢癌细胞铁死亡易感性的贡献者的作用。
在其他生化功能中，过氧化物酶体对细胞溶质活性氧进行解毒，并启动超长链和支链脂肪酸的降解。此外，过氧化物酶体参与醚连接的甘油酯的生物合成，与酯连接的二酰基甘油酯(R1CH2CO2CH2R2)不同，其在甘油sn-1位置具有醚键(图2a，扩展数据图3a)。醚磷脂包括两个亚型:1-O-烷基-甘油磷脂(r1ch2ch 2 och 2r2)；和1-O-烯基-甘油磷脂(R1CH=CHOCH2R2)，称为缩醛磷脂。大多数缩醛磷脂在sn-2位置具有酯连接的多不饱和脂肪酰基(PUFA)链(图2a)。与过氧化物酶体的脂质合成功能一致，脂质组学图谱显示在PEX3-和PEX10-耗尽细胞中均有选择性的醚甘油脂类损失；这种减少对于多不饱和醚磷脂(PUFA-ePLS)来说最为显著，多不饱和醚磷脂可能主要是缩醛磷脂(图2b，扩展数据图3b，补充数据3，4)。（换言之就是过氧化物酶体参与缩醛磷脂的合成，并且缩醛磷脂主要就是多不饱和醚磷脂）
因为AGPS和FAR 1——催化醚类脂生物合成的两种过氧化物酶体相关酶——也在CRISPR筛选中名列前茅，我们提出醚类脂生物合成可能是过氧化物酶体的促铁死亡作用的组成部分。事实上，CRISPR-Cas9介导的AGPS基因或FAR1基因的缺失，无论是在群体中还是在衍生的单细胞克隆中，都概括了铁死亡抗性表型和过氧化物酶体缺失时观察到的醚磷脂的伴随变化(图2c-g，扩展数据图3c-m，4a-e，补充数据3，4)。CRISPR-Cas9敲除程序的特异性通过将抗sgRNA的Agps或Far1cDNAs引入这些细胞来逆转这些表型来验证(扩展数据图5a-c)。
通过野生型细胞中异位cDNAs的过度表达、短发夹RNA(shRNA)介导的基因敲除和AGPS13小分子抑制剂的使用(扩展数据图5d-h)，进一步证实了乙醚脂质生物合成途径的促铁作用。相比之下，剔除与乙醚脂质代谢无关的两种过氧化物酶体——超氧化物歧化酶1(由SOD1编码)和过氧化氢酶(由CAT编码)——并没有改变细胞对铁死亡的敏感性(扩展数据图5i–k)，这与过氧化物酶体的促铁死亡作用是由乙醚脂质生物合成特异性介导的一致。值得注意的是，过氧化物酶体或醚脂质的减少也降低了GPX4依赖性HhH-7肝细胞癌和SNU-685子宫内膜癌细胞对铁死亡的敏感性(扩展数据图6a-e)。此外，对以前脂质组学数据的分析显示，与正常肾组织相比，ccRCC肿瘤(一种已知易受铁敏感3的癌症类型)表现出更高水平的多不饱和脂肪和增加的AGPS表达(扩展数据图6f)。这些分析表明，乙醚脂质生物合成途径的促铁死亡作用可能适用于其他癌细胞类型和人类癌症。
值得注意的是，在过氧化物酶体减少的细胞中，醚磷脂的损失发生在ACSL4或溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3(LPCAT3)——大多数细胞多不饱和脂质生物合成中的限速酶——水平没有显著变化的情况下(扩展数据图7a，b)。ACSL4与过氧化物酶体和醚脂质生物合成基因的共同缺失导致了对铁死亡的进一步保护——类似于铁死亡抑制剂铁抑制素-1(Fer-1)所赋予的效果(扩展数据图7c，d)。这些观察表明非过氧化物酶体衍生的PUFA脂质参与了铁死亡，并指出一种潜在的组合策略，该策略包括抑制ACSL4和PUFA-ePL生物合成酶来阻断铁死亡。
乙醚脂质生物合成是通过过氧化物酶体与内质网(ER)的功能协作实现的。在过氧化物酶体中，酶FAR1、GNPAT和AGPS作用于合成醚类脂前体1-O-烷基-甘油-3-磷酸(AGP)。然后AGP被送到内质网，在那里它在甘油的sn-2位被酰化，头基被加到sn-3位，在缩醛磷脂的情况下，通过脱氢形成双键，形成链烯基醚连接。虽然sn-2位的PUFA加成对于铁死亡相关的醚类脂的合成至关重要，但尚不清楚是哪种内质网酶介导了这一过程。我们在两个CRISPR screening(图1b，扩展数据图1a，b，f，g)中发现ER-驻留酶1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶3(由AGPAT3编码)。AGPAT3在人类单倍体KBM7细胞的CRISPR筛选中也是促铁死亡的。值得注意的是，据报道AGPAT3选择性地将花生四烯酸或二十二碳六烯酸结合到溶血磷脂酸中，导致二酰基PUFA-磷脂酸的合成。然而，AGPAT3是否也有助于AGP酰化和PUFA-ePL生物合成尚不清楚。（介绍了一下脂质代谢相关内容，真是搞基础必须基础好才行）
为此，我们进行了脂质组学分析，显示AGPAT3的耗尽选择性地降低了醚连接和二酰基磷脂中多不饱和物质的水平(图2h，扩展数据图7e，补充数据3，5)。与上述一致，AGPAT3的基因缺失抑制了对铁死亡的敏感性(图2i，扩展数据图7f–j)，证实了AGPAT3的促铁死亡作用。此外，CRISPR抗性的野生型Agpat3基因的表达在AGPAT3缺失的细胞中恢复了铁死亡敏感性，而催化死亡的Agpat3E176A变异体未能做到这一点(扩展数据图7k，l)。这些结果表明AGPAT3在过氧化物酶体途径的下游起作用，在内质网中合成PUFA-ePLs(扩展数据图8a)。
为了证实PUFA-ePLs是必需的，并足以诱导对铁死亡的敏感性，我们将各种二酰基和醚磷脂配制成脂质体纳米颗粒，用于递送至细胞(扩展数据图8b)。在含乙醇胺的磷脂中，应用C18(浆)-C20:4PE、C18(浆)-C22:6PE或C18:0-C20:4PE-但不应用C18(浆)-C18:1PE-导致OVCAR-8细胞中的铁死亡敏化(其中(浆)表示链烯基-甘油磷脂；扩展数据图8c)。在含胆碱的磷脂中，C18(血浆)-C20:4PC——但不是C18(血浆)-C18:1PC——显示出显著的铁死亡敏化活性，而C18:0-C20:4PC、C18(血浆)-C22:6PC和C16(-O-)-C20:4PC显示出中间效应(扩展数据图8d，e)。在PEX3-、PEX10-或AGPS贫化OVCAR-8和786-O细胞中观察到类似的效果(扩展数据图8c，d)。这些结果表明，PUFA链的存在——而不是烯基醚基团——对铁死亡敏化是至关重要的。
为了排除摄取后应用的PUFA-ePL细胞内转化为其他磷脂的可能性，我们使用脂质纳米粒给药后立即在GPX4抑制的细胞中进行BODIPY-C11氧化的延时成像来评估脂质过氧化水平。该分析显示，C18:0-C20:4PE和C18(血浆)-C20:4PE均在添加后10分钟内诱导脂质过氧化迅速增加，而C18(血浆)-C20:4PC诱导的过氧化水平略高于C18:0-C20:4PC(扩展数据图9a-e)。这些数据表明PUFA缩醛磷脂在GPX4抑制的细胞中确实被氧化了。PUFA-ePE和PUFA-ePC (ePE，醚连接磷脂酰乙醇胺；用ML210处理的细胞中的ePC(醚连接的磷脂酰胆碱)水平，即使处理时间短至90分钟，这种处理使细胞处于存活状态，即使它们经历由脂质过氧化诱导的磷脂水解增加(扩展数据图9f，补充数据6)。
我们接下来评估过氧化物酶体是否也促进体内对铁缺乏的敏感性。由于缺乏适用于体内使用的GPX4抑制剂，我们产生了GPX 4/-OVCAR-8和786-O细胞，它们依赖铁死亡抑制剂Fer-1来维持其活性。与表达非靶向阴性对照sgRNAs(sgNC)的GPX4/-细胞相反，在没有Fer-1的情况下，GPX4/-细胞经历了快速的铁死亡，同时也耗尽PEX3、PEX10、AGPS或FAR1，显示出体外生存力增加(图3a，扩展数据图10a)。当植入免疫缺陷小鼠体内时，GPX4+/+细胞迅速形成肿瘤，而GPX4/-SGNC细胞的肿瘤形成明显延迟，表面上是因为这些细胞在体内经历了铁死亡；然而，伴随GPX4和AGPS、FAR1、PEX3或PEX10缺失的细胞在第6周形成了比GPX4/-SGNC细胞更大的肿瘤(图3b)。这些结果表明，过氧化物酶体-醚-脂质轴在体外和体内都有助于铁死亡敏感性。值得注意的是，我们的数据表明，AGPS-、FAR1-、PEX3-或AGPAT3-缺失的癌细胞可以在体外和体内健壮生长(图3a，b，扩展数据图10b–e)。这些结果表明，醚磷脂对原发性肾癌和卵巢癌的生长是不可缺少的，尽管它们的富集易导致铁死亡。
我们还研究了癌细胞是否能够进化出策略来逃避实验诱导的铁死亡。我们观察到，在OVCAR-8和786-O肿瘤异种移植物中，易发生铁死亡的GPX4细胞最初似乎不能在小鼠体内定居；然而，在潜伏期后出现大的肿瘤结节(图3b，c)。我们成功地从出现的786-O肿瘤中分离出癌细胞，并证实这些细胞保持GPX4-/-(图3d)。将这些明显抗铁死亡(FR1)细胞重新植入小鼠体内，导致肿瘤生长健壮，没有明显的潜伏期(图3e)，这意味着FR1细胞获得了一种或多种细胞遗传特性，使其对GPX4缺失不敏感。
为了探索体内观察到的逃避铁死亡的机制，我们对从GPX4-/-FR1细胞(称为FR2细胞)形成的肿瘤中分离的细胞进行了代谢组学和脂质组学分析。我们发现，相对于从亲代、铁死亡易感性肿瘤制备的细胞中的水平，PUFA-ePLs在FR2细胞中是最显著下调的脂质(图3f-h，扩展数据图10f-h，补充数据7)。这些结果表明，ccRCC细胞可以调节其PUFA-ePL水平，这种生化可塑性可能有助于体内铁死亡的逃避。（铁死亡并不一定只是起到抗肿瘤作用，肿瘤细胞可以通过代谢的调节从而适应这种脂质过氧化损伤进而促进肿瘤生长，换言之，就是遗传性铁死亡易感性可以通过代谢的调节从而产生铁死亡抵抗）。
我们接下来评估了在ccRCC细胞中观察到的PUFA-ePLs的下调是否可能是由有缺陷的过氧化物酶体生物发生驱动的。与来自亲代肿瘤的细胞相比，我们在FR2细胞中没有发现过氧化物酶体丰度的重大变化(扩展数据图10i)。
此外，外显子组测序仅揭示了FR2细胞中的一个非同义体细胞突变:TLR7的一个小的移码缺失，这在我们的CRISPR筛选中没有发现，也没有报道与铁死亡相关的功能(补充数据8)。然而，RNA测序显示，在87个已知的过氧化物酶体和醚脂质生物合成基因中，AGPS和TMEM189(也称为PEDS1)在FR2细胞中显著下调——这种降低在蛋白质水平上得到验证(图3i，j，扩展数据图10j，k，补充数据8)。其他已知的铁死亡调节基因——包括ACSL4、LPCAT3和AIFM2(编码FSP1)22、23——的表达水平没有显著改变(扩展数据图10k，l)。（既然认为GPX4和AGPS/TMEM189具有相关性，那如何GPX4通过什么改变了这两个基因的表达呢？）
TMEM189编码1-O-烷基-PE去饱和酶，该酶将1-O-烷基醚转化为1-O-烯基醚，并在癌症依赖性图谱中显示与ACSL4、PEX3和FAR1的共依赖性(扩展数据图11a)。然而，TMEM189在我们的CRISPR screen上并没有获得显著的hit。此外，使用CRISPR-Cas9、shRNA或cDNA干扰TMEM189水平并未显著改变受试细胞系对铁死亡的敏感性(扩展数据图11b-g)，这意味着PUFA-ePLs的促铁死亡作用与烯基-醚键中存在的双键无关。相比之下，我们发现AGPS失活(消耗1-O-烷基脂质和1-O-烯基脂质)足以恢复GPX4肿瘤的生长。这表明AGPS的自发下调——而不是TMEM189——导致了在ccRCC模型中观察到的铁死亡抗性的出现。
然后我们探讨了PUFA-ePLs的铁死亡作用是否与非肿瘤环境相关。我们选择将神经元和心肌细胞分别视为大脑和心脏的主要细胞类型——表现出高ePL水平的重要器官，据报道在某些病理条件下会发生铁死亡。在SH-SY5Y神经元分化模型中，我们发现分化的神经元比亲代细胞对GPX4抑制诱导的脂质过氧化和铁死亡表现出更高的敏感性，这种差异与神经元中上调的PUFA-ePEs和PUFA-ePCs有关(图4a-c，扩展数据图12a-e，补充数据9)。
我们还发现来源于人类诱导多能干细胞(iPS细胞)的心肌细胞比来源于iPS细胞的心脏祖细胞对GPX4抑制更敏感(图4d，扩展数据图12f，g，补充视频2)。在用ML210治疗的心肌细胞中观察到具有铁死亡样形态的细胞死亡，并且通过与liproxstatin-1或Fer-1共同治疗来防止细胞死亡，但是没有通过与坏死抑制因子坏死抑制因子-1或凋亡抑制因子z-VAD-FMK共同治疗来防止细胞死亡(扩展数据图12h，I，补充视频3)。
我们的脂质组学分析进一步揭示，与心脏祖细胞相比，心肌细胞显著上调PUFA-ePCs和PUFA-ePEs(图4e，扩展数据图12j，补充数据10)。此外，敲除PEX3或AGPS降低了心肌细胞对铁死亡的敏感性(图4f，扩展数据图12k)，表明PUFA-ePLs上调有助于提高心肌细胞的铁死亡敏感性。总之，PUFA-ePLs的选择性上调与神经元和心脏谱系的铁死亡易感性状态相关(图4g)。
我们在这里描述了过氧化物酶体和PUFA-ePLs在调节癌症以及神经元和心脏疾病中铁死亡易感性中的重要性。此外，通过下调ePL生物合成酶的表达来促进低PUFA-ePL状态的获得，可导致携带ccRCC的宿主逃避铁缺乏症和肿瘤复发。尽管缩醛磷脂——主要的PUFA-环氧丙烷类型——由于其烯基醚基团的反应性而被视为抗氧化剂，但我们的研究描述了一种额外的亲铁死亡作用，这种作用对在sn-2位具有PUFA的环氧丙烷是特异性的。鉴于已发现阿尔茨海默病患者的尸检脑样本表现出显著降低的缩醛磷脂水平，有必要进一步研究缩醛磷脂介导的铁死亡在神经退行性变中的作用。我们还注意到，据报道，心肌细胞的铁死亡会导致化疗和缺血再灌注诱导的心肌疾病，并且铁螯合剂右丙氧烷是食品药品监督管理局批准的治疗阿霉素诱导的心脏毒性的唯一药物。这些不同的发现表明，铁死亡的诱导可能是一种强有力的抗癌策略，阻断铁死亡过程可能有助于预防或减轻对大脑和心脏的各种损伤。
