SDS-PAGE—快速制胶0失误

  “SDS-PAGE”是指“聚丙烯酰胺凝胶电泳”(polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE)。

    原理:聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应。分为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE);非变性聚丙烯酰胺凝胶,在电泳的过程中,蛋白质能够保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。SDS-PAGE最初由shapiro于1967年建立,他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂(SDS即十二烷基硫酸钠)后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(可以忽略电荷因素)。

    聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合(实验室常用)以过硫酸铵(APS)为催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中,TEMED催化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联,从而形成三维网状结构。

    制好一块蛋白胶是WESTERN BLOT,PULL DOWN, Co-IP等实验的基础。虽然是个很简单的步骤,但也有许多值得注意的地方。实验小白的经验总结,大家可以参考参考。

  1.制胶用的胶板和梳子需要提前用ddH2O清洗干净。检漏时可以开始配置分离胶。

  2.检漏后需要用纸把水吸干净,避免有水残留。

  3.加入分离胶后用ddH2O封平,加水时用移液枪水平缓慢加入,一是为了使分离胶界面保持水平,用水就可以把它压平,使蛋白质分子跑时在同一水平线上;二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。封好后一般静置15分钟左右。等待时间可以制备浓缩胶。

    4.待分离胶与水出现分层即表示分离胶凝固好了,吸干净水(否则易导致浓缩胶与分离胶中间有空隙)。用移液器缓慢加入浓缩胶(不要有气泡,可以不用把移液器里的液体打干净,这样不容易有气泡;有气泡了可以加入更多液体使气泡上浮再用移液器吸走气泡),及时插入梳子,静置15分子左右。

    5.一般加入TEMED(剧毒,使用时注意)的量按使用说明的量加入,夏季温度高时切勿多加。冬季温度低时可适量多加2到5微。

  个人心得,仅供参考。如有疑问,欢迎交流。

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