Hansen O K, McKinney L V. 2010. Establishment of a quasi-field trial in Abies nordmanniana-test of a new approach to forest tree breeding. Tree Genetics and Genomes, 6(2): 345–355.

本研究使用DNA标记在由开放授粉的克隆种子果园（CSO）中收集的种子生产的生产圣诞树架内建立类似野外试验。共有来自CSO的660名后代，其中包含99个克隆的Abies nordmanniana，用12个微卫星进行基因分型。亲子被成功分配到93％和98％的后代，分别为95％和80％的置信度。当标记数减少到10时，转让率只下降到90％。在CSO克隆中，子代对子代的分配高度偏差。在7％的病例中，最成功的克隆被分配为父母，119个潜在亲本基因型中只有92个被分配为父母。所获得的谱系用于估计与圣诞树育种相关的五个字符的CSO克隆的育种值。对于高遗传性状，例如萌芽，可以估计相当大比例的克隆的准确的育种值。对于估计低遗传性状（如圣诞树质量评分）的育种价值，将需要更多的基因型后代。该方法的最大缺点是种子果园中父母间亲属分布偏高，难以计算所有克隆的育种值。该方法似乎非常适合于树木育种，更重视纯种选择的亲本基因型，而不是估计定量遗传参数。

前言

世界上最先进的针叶树育种计划仅在第三代或第四代（Pinus taeda，Pinus radiata，Pseudotsuga menziesii; Yanchuk 2004）。这与农作物育种形成鲜明对照，农作物育种具有悠久的驯化历史，具有数十甚至数百个繁殖世代。【原因】起步晚：这种差异有很多原因;一个明显的原因是选择性树种育种直到二十世纪中叶才开始（Burley 2004）。另一个因素是树木育种的长期期限，生成周期长。树种繁殖涉及需要大量空间和工作人员的大型生物，所有这些都投入到三至四十年的希望中。此外，林业产品的多样性大于农业（Namkoong等，1988）。无论树种繁育的起因如何，似乎至少在许多西方国家，已经通过了树种育种的全盛时期。在这些地区，有传统育种计划资金减少的趋势，体制和经济变化改变了传统的森林树种育种方法，例如，通过将合作结构置于压力之下，缩短计划范围，并从现场工作转向生物技术（Burdon，2004）。这是我们研究的背景，这表明通过利用生物技术来帮助缩短规划范围，同时仍然使用定量育种方法。基本思想是使用分子标记物以更灵活的方式建立现场试验，从而避免传统方法的一些风险和精细的组成部分。这种新方法通过在种子果园后代的生产机构中的亲本分析建立了已知的关系，并随后在定量遗传分析中分析了树木。其他人也有同样的想法，最近El-Kassaby等人（2007）介绍了他们的“繁殖没有繁殖”的方法。我们的方法是“准实地试验”。

准场试验的一个先决条件是出现了高度多态性的DNA标记，如微卫星，可以揭示种子果园中的精确授粉模式（例如，Moriguchi等人，2004）。其他的则是最大可能性方法的发展（例如Searle 1995），以及ASReml（Gilmour et al。2006）等匹配软件，可以估计非常不平衡的交叉方案的方差分量，这些方法通常是公开授粉的后代的结果。除了这些创新之外，越来越多的基因座对大量个体进行基因分型的发展，并以更低的成本提取DNA也使得该方法的实际应用成为现实。考虑到这些领域的最新发展，已经可以通过我们这样的研究来说明这种方法的优势。

由于建立和测量之间的长时间，树种育种人员经常失去田间试验，才能产生任何结果。可能破坏森林野外试验的一些不幸包括森林火灾，风暴，冰暴，昆虫，动物和疾病的破坏，城市转型和破坏行为（Libby等，1969）。在我们的圣诞树育种计划中，由于鹿的浏览或春季霜冻，现场试验已经失败，这两种情况都可能严重破坏树木，并使后期的实地测量毫无意义。所有这些事件中的共同点是，建立现场审判的费用已经得到支付（例如跟踪单独的种子批，每个个人/家庭的标签和注册以及制作实地审判报告），而没有得到任何结果。准场试验的最大优点之一是它们的灵活性和不依赖于连续性。与传统的现场试验相反，需要工作人员和机构资源来建立试验，多年后进行维护和分析，可以同时完成对准实地试验的建立和开采，从而降低资源浪费的风险，从未测量过可以在收集基因分型样品的同时测量准场试验，从而完全消除风险。如果传统的实地试验失败，可能没有第二个选择来获得结果。另一方面，来自克隆种子果园（CSO）的种子可能导致许多生产台，从而提供几种选择来建立准实地试验。
此外，该方法促进了替代选择和测量方案，其中仅选择生产台的次要子集（最佳个体）并进行基因分型。这项研究的目的是通过使用DNA标记和亲本分析来测试一种新的树种育种方法，以建立准野外试验并估计育种基因型的育种价值。该研究使用了丹麦诺德曼尼亚（Nordmann fir）的一个CSO，它是一种在丹麦生长的异乎寻常的针叶树，用于生产圣诞树。讨论了使用准场试验的一般问题和观点。

讨论和结论

使用分子标记物来估计定量遗传参数的想法是长期的（Thompson 1975; Queller and Goodnight 1989）。 Ritland和Ritland（1996）通过报告黄猴花（Mimulus guttatus）的天然种群，对植物进行了首例研究。
在森林树木改良中，分子标记已被用作研究来自CSO的种子作物的遗传组成的工具。检查不均匀的父亲贡献，自交和花粉污染（Adams和Joly 1980; Muona和Harju 1989）。 Lambeth等人（2001）介绍了使用父亲分析法使花粉组合育种成为高成本和逻辑上困难的全同胞杂交方案的有效替代方案。最近的研究通过对来自CSO的田间试验中的后代进行基因分型，研究了自交和父系失衡对遗传参数和EBV的影响（Doerksen and Herbinger 2008; Gaspar et al。2009; Hansen and Nielsen 2009）。
然而，使用Grattapaglia等人的亲子鉴定检索桉树精英父母的回顾性选择。 （2004）是我们所知道的第一次亲子鉴定分析的CSO后代被证明是一种繁殖方法。 El-Kassaby等人（2007）进一步发展和体现了这一想法，他们称之为“不育育”。我们在El-Kassaby等人出版之前发起了我们的研究。 （2007），但是这种做法是相似的，从而进一步说明了这个概念。
除父母分析外，其他基于DNA的家系重建方法也存在，例如，亲属关系分析，其中包括关系类别的相关性估计和分组（Blouin 2003）。这些方法旨在估计群体水平参数，如遗传力，交配选择或基因流。然而，在我们这种情况下，在后向选择的育种背景下，血统本身是直接的兴趣，父母分析成为明显的选择。此外，用于估计定量遗传参数的非基于谱系的标记方法在几个近交生物研究中已被证明是不精确的（Pemberton，2008）。在父母分析领域，只有分类分配（Jones和Ardren 2003）是真正的兴趣，因为我们需要估计特定个体（父母）的育种价值，这又意味着需要一个特定的谱系。

Lundbygaard的亲子分析

这项研究在将父母分配给子孙后的成功率很高。当从另一个种子来源的后代被排除在分析之外（第5行和第8行（其中只有82个后代中只有一个可以分配一个父对）时，98％的树被分配了80％置信度的父对，93％ 95％的信心。两个置信水平的分配率之间的边际差异也证实了母体分析的鲁棒性。作为对这种健壮性的额外测试，我们在先前分析的A.nordmanniana材料集合（Hansen和Nielsen 2009）中进行了亲本分析。这包括一个公开授粉的半同胞试验，来自CSO，有23个亲本克隆，每个由约28棵树组成，全部都有一个已知的母亲，但未知的父亲。假定的已知母亲和后代之间的基因型不匹配的树被排除在外，留下了596个我们确定母亲身份的后代。然后将母亲的身份从数据集中删除，并且进行了与FP1100后代类似的亲子鉴定分析，尽管只有六个微卫星的基因型可用。结果同样成功，母亲对以87％的后代赋予95％的信心。此外，596个人中有15人（97.5％），已知母亲被指定为最可能的父母双亲中的父母之一。
这个高成功率的一个原因可能是丹麦针叶树种子果园的花粉污染通常小于5％（Hansen和Kj？r 2006; Hansen 2008; Hansen和Nielsen 2009）。嫁接克隆和未知“入侵者”之间共享父系的实例不会提供成对的父对对子代的分配。一个解决方案可能是分配一个单亲（母亲）来估计育种值。高花粉污染将难以估计育种男性人口（NBMP），这是CERVUS家长分析中所需的候选父母数量的一部分。模拟研究表明，NBMP的准确估计对于优化CERVUS的亲子鉴定研究的可靠性很重要（Oddou-Muratorio等，2003）。由于花粉污染少，潜在父母的数量将接近CSO的克隆数量，尽管花粉和种子的贡献不同可能降低这一估计的准确性。
针叶树种子园中低花粉污染可能是因为在丹麦几乎没有土着针叶树种，只有少数引进的种类大量种植。另外，在诺曼德氏菌（A.nordmanniana）的情况下，通常在开花前一年的时间内将树木收获为圣诞树，通常在28-35年后开始。这在本研究中得到了支撑，因为CSO的根茎在1998年为23岁，当时为Lundbygaard后代收获种子，而亲本分析显示，长满根的砧木通常不参与种子生产。在FP1100中，花粉污染也较低。如果我们使用在FP1100中没有发现父母等位基因的次数，不包括第5行和第8行的树木，则我们收到20/569 = 3.5％的花粉污染估计值。
El-Kassaby等人（2007）采用了59株克隆的道格拉斯种子果园，花粉污染率达30％以上。这将浪费更多的基因分型努力比我们的研究，但是在许多情况下看到的高花粉污染可能会被补充大量授粉（SMP）抵消，正如Bridgwater等人所提出的。 （1993）。

数量遗传估计

获得的遗传力估计高，除了圣诞树质量得分。一个大型传统的田野试验系列，1997年成立，共有11个场地，单棵树种植了3万多棵树，高度和圣诞树质量得分分别为0.16和0.10，遗传率估计（Ulrik Br？uner Nielsen，发现数据）。准实地试验估计了圣诞树质量得分完全相同的遗传力，从而支持这一特征是一个低遗传特征，许多因素也是环境因素可以影响的。使用准实地试验的最方便的特征，即避免将单个种子收集物从个别克隆中分离出来并分开分批培育幼苗也可能是其最严重的缺点。母亲（种子）和父亲侧（花粉）可能发生的高度偏差的亲子鉴定贡献意味着，CSO中的一些克隆不会有或很少的后代。在公开授粉的半同胞测试的传统育种方法中，可以通过确保来自每个种子父母的相等数量的幼苗来平衡母亲方面的测试方案。在最佳情况下（最高螺旋分支），我们可以在CSO的其余99个克隆中获得57个准确的EBV（58％），高度为39个克隆（39％），遗传性状，圣诞树质量得分，数量只有两个。因此，育种者必须考虑在CSO中为所有克隆获得育种价值的重要性，以及改良性状。然而，尽管具有准确的EBV的克隆数目远远超过克隆总数，但是对于大多数性状，具有准确EBV的克隆占总亲本的75％以上，从而使配子对生产的贡献。为了增加提供足够数量的后代的克隆数量，从而增加可靠的EBV，一种可能性是确保SMP的授粉成功。然而，这也需要更多的工作，并要求所有克隆的可用花粉。【遗传力低怎么办】在遗传性极低的性状的育种中，另一种方法可能是仅在具有所需特性的选定后代中分析亲本。
准野外试验的使用消除了对一些假设的依赖，例如，在公开授粉的后代试验中假设真正的半同胞，尽管不能实现这一假设的后果很小（Hansen和Nielsen，2009年）。然而，其他假设仍然是相关的，例如母本效应问题。当进行公开授粉的测试或交配设计时，没有相互的交叉，假定产妇的影响可以忽略不计。在准场试验中，我们可能会收到一组父母，但不知道哪位父母是母亲，哪位是父亲。因此，精确估计育种值对于测量性状不需要或只有较小的母体效应。规避对这一假设依赖的一种方法可能是包括单方面遗传的标记。在松果科的针叶树中，这可以通过线粒体标记（通常是母体遗传的）或通常是父系来源的叶绿体标记来实现（Wagner 1992）。高度多态性的标记在针叶树的线粒体DNA中是不可缺少的，但SSR标记已被鉴定并应用于针叶树叶绿体DNA，而在Abies物种中，它们具有特别高的变异性（Vendramin等人1999; Hansen et al。2005b），所以这可能是确定母亲和父亲身份的机会。

未来使用类实地试验和不同的育种策略

该研究旨在获得尽可能多的FP1100克隆的EBV。然而，在同一领域看到Lundbygaard的40,200个FP1100后代的大型展台，可能会考虑另一种使用基因分型工作。而不是在一个选定的场地中对650个人进行基因分型，可以通过整个领域进行基因分型，并选择具有最大圣诞树质量得分的650棵树。这也将确定具有良好圣诞树分数的后代产生的最高概率的克隆，但具有更高的选择强度。对于高遗传性状，该方法只能确定CSO中有限比例的克隆，例如，大多数识别的亲本将是100个克隆中的10个克隆中的10个。因此，估计遗传参数如遗传因素的意义较小，因为我们正在从有限的部分克隆中测量后代，因此重点将放在纯粹的选择上。在这个意义上说，林木育种将会回归到基础，但没有估计效应的大小。生产台中选定个体的基因分型的一个缺陷是亲属分布的偏差。如果CSO中的几个克隆捐赠了几乎所有的种子和花粉，也许所有的坏圣诞树都是主要克隆的后代。换句话说，性状上没有遗传变异 - 变化是单纯的环境。为了避免对（克隆）克隆的优越性作出错误的结论，人们还必须在角色频谱的另一端（例如，坏的圣诞树）将基因分类为个体的一部分。这可以证实，好的和坏的树的父母是不一样的。技术开发不断提高了使用DNA标记物进行这种育种的可行性。可靠的多重PCR试剂盒减少了实验室工作量，并提供了在同一PCR反应中包含多达10个标记的机会。我们的研究表明，10个标记提供了足够的亲子鉴定成功，即使CSO中克隆数量相对较多。如果PCR和片段分析可以限制在每个样品一次运行，这将显着降低实验室成本，降低数据处理和错误风险。基因分型针叶树技术开发的下一步是生产完全自动化的DNA提取过程。这项研究已经证明了标记在育种计划开始时的适用性。在理论和实践两方面，仍然有待研究，这种方法是否有用，并且与长期的树种育种相结合，具有更多的先进世代。

结论

在CSO的后代建立一个使用12个微卫星的准实地试验，产生了有希望的结果，具有较大的育儿成功率。当标记的数量减少到10并且通过排除两条特定的树行而不是来自假定的种子来证明其精度时，该方法工作良好。分配亲本的大部分后代可能与CSO中低花粉污染密切相关。鉴于分析中包含的树木数量少，所以定量遗传参数的估计是令人满意的。对于高遗传性状如潮红，准确的育种值可以估计为亲本基因型的合理分数。然而，诸如圣诞树品质分数等低遗传特性需要更多的基因型后代在育种中具有实际价值。该方法的最大缺点是种子果园中父母间亲属分布偏高，难以获得所有相关克隆的育种价值。这种方法似乎非常适合于改变进行树种育种的方式，即更加强调基于生产站点中选定个体的基因分型的亲代基因型的纯选择，而较少的是估计定量遗传参数。在技​​术上，针叶树DNA的自动DNA提取将是使针叶树育种技术更可行的最大的进步。