1. 超几何检验GO、KEGG基因富集分析
这是相对简单粗暴一些的基因富集分析方法，不需要输入基因的表达值，只需要通过自己设定的阈值(|log2FC| >1 和Pvalue < 0.05)筛选得到的差异基因名。进行统计检验后返回显著富集的功能基因集。如DESeq2 (获得差异基因信息)，clusterProfiler（ID转换+富集分析+作图一站式神包！）
2. GSEA富集分析
相比于第一种简单粗暴的用硬阈值截取+往篮子里塞鸡蛋的方法，GSEA同时考虑了基因在整个表达谱中所处的FoldChange rank以及同一基因集中的基因在表达谱rank中的距离。通俗来讲，GSEA基于如下假设：一个基因集中的基因如果在表达谱中所处的rank越极端（高/低FoldChange），而且基因之间的距离越短（rank相近），则这个基因集越可能显著。所以GSEA需要输入的是【所有纳入差异分析的完整基因list和它们的FC值，并已经预先排序（pre-ranked）】。
具体的原理参考，https://cloud.tencent.com/developer/article/1426130
它能帮助生物学家在两种不同的生物学状态 (biological states)中，判断某一组有特定意义的基因集合的表达模式更接近于其中哪一种。因此GSEA是一种非常常见且实用的分析方法，可以将数个基因组成的基因集与整个转录组、修饰组等做出简单而清晰的关联分析。
除了对特定gene set的分析，反过来GSEA也可以用于发现两组样本从表达或其它度量水平分别与哪些特定生物学意义的基因集有显著关联，或者发现哪些基因集的表达模式或其他模式更接近于表型A、哪些更接近于表型B。这些特定的基因集合可以从GO、KEGG、Reactome、hallmark或MSigDB等基因集中获取，其中MSigDB数据库整合了上述所有基因集。研究者也可自定义gene set (即新发现的基因集或其它感兴趣的基因的集合)。
GSEA分析似乎与GO分析类似但又有所不同。GO分析更加依赖差异基因，实则是对一部分基因的分析 (忽略差异不显著的基因)，而GSEA是从全体基因的表达矩阵中找出具有协同差异 (concordant differences)的基因集，故能兼顾差异较小的基因。因此二者的应用场景略有区别。另外GO富集是定性的分析，GSEA考虑到了表达或其它度量水平的值的影响。另外，对于时间序列数据或样品有定量属性时，GSEA的优势会更明显，不需要每个分组分别进行富集，直接对整体进行处理。可以类比于之前的WGCNA分析。
GSEA定义
Gene Set Enrichment Analysis (基因集富集分析)用来评估一个预先定义的基因集的基因在与表型相关度排序的基因表中的分布趋势，从而判断其对表型的贡献。其输入数据包含两部分，一是已知功能的基因集(可以是GO注释、MsigDB的注释或其它符合格式的基因集定义)，一是表达矩阵 (也可以是排序好的列表)，软件会对基因根据其与表型的关联度(可以理解为表达值的变化)从大到小排序，然后判断基因集内每条注释下的基因是否富集于表型相关度排序后基因表的上部或下部，从而判断此基因集内基因的协同变化对表型变化的影响。
(The gene sets are defined based on prior biological knowledge, e.g., published information about biochemical pathways or coexpression in previous experiments. The goal of GSEA is to determine whether members of a gene setStend to occur toward thetop(or bottom) of the listL, in which case the gene set is correlated with the phenotypic class distinction.)
这与之前讲述的GO富集分析不同。GO富集分析是先筛选差异基因，再判断差异基因在哪些注释的通路存在富集；这涉及到阈值的设定，存在一定主观性并且只能用于表达变化较大的基因，即我们定义的显著差异基因。而GSEA则不局限于差异基因，从基因集的富集角度出发，理论上更容易囊括细微但协调性的变化对生物通路的影响，尤其是差异倍数不太大的基因集。
GSEA原理
给定一个排序的基因表L和一个预先定义的基因集S(比如编码某个代谢通路的产物的基因, 基因组上物理位置相近的基因，或同一GO注释下的基因)，GSEA的目的是判断S里面的成员s在L里面是随机分布还是主要聚集在L的顶部或底部。这些基因排序的依据是其在不同表型状态下的表达差异，若研究的基因集S的成员显著聚集在L的顶部或底部，则说明此基因集成员对表型的差异有贡献，也是我们关注的基因集。
3. GSEA与常规富集分析的区别在哪里呢？（敲黑板，划重点）
常规富集分析必须先做差异筛选，用筛选的基因（无论多少）进行功能富集，这种方式可能由于筛选参数的不合理导致漏掉一些关键信息。
而GSEA无需做差异分析，直接拿所有基因的表达量即可找到实验组和对照组有一致性差异的感兴趣的通路。好处就是，不经筛差异可以保留了这些关键信息，进而找到那些差异不很明显但是基因差异趋势很一致的功能基因集。
当然，常规富集分析和GSEA分析没有说哪个更好，实际应用中能解决问题即可，引用一句名言：黑猫白猫，能抓住老鼠的就是好猫
3. GSVA/ssGSEA分析
ORA（GO、KEGG基因富集分析）只需要提供差异基因列表，GSEA富集分析还需要提供对应差异倍数信息。但二者都是基于差异分析得到的结果。
Gene set variation analysis (GSVA)与Single sample GSEA (ssGSEA)这两种方法是都基于单样本的基因表达信息计算每个通路的相对表达活性，然后基于此可计算样本间的通路表达活性的差异分析。由于这两种算法相似，就不做过多的区分。
相当于把基因表达矩阵（列：样本，行：基因 ）变为一个通路/基因集活性表达矩阵（列：样本，行：通路/基因集），所以不同于上方以组别为单位（cancer vs normal）的GSEA分析，通过ssGSEA，每个样本都可以得到相应基因集的评分。
可使用GSVA包进行分析，以下的学习代码最主要来自该包的官方文档：https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/GSVA/inst/doc/GSVA.html
a. 首先假设有一个样本的表达数据，那么他应该是这样的，第一列为基因，第二列为表达值，这样的两列的数据矩阵。
首先对样本的所有基因的表达水平进行排序获得其在所有基因中的秩次rank，这些基因的集合为BG。
b. 假设要对其进行KEGG的分析，首先我们需要在GSEA官网找到KEGG对应的gmt文件。
gmt文件主要格式是：每行表示一个通路，第一列为通路ID，第二列为通路对应的描述，第三列开始到最后一列为该通路中的基因。
c. 那么对于任意的一个通路A，我们可以拿到这个通路的基因列表GL，从GL中寻找BG里存在的基因并计数为NC，并将这些基因的表达水平加和为SG。
开始计算ES：对于任意一个表达谱中的基因 G，如果G是集合GL中的基因则他的ES等于该基因的表达水平除以SG，否则记该基因的ES等于1除以（基因集合BG总个数减去NC）
依次计算每个BG中的基因的ES值，找到其中绝对值最大的ES作为通路A的A.ES
d. 到此通路A的ES计算完毕，需要一个统计学方法来评估该ES是否是显著的，即非随机的。
按照上述计算ES的方法，先随机打乱表达谱中基因的表达顺序，然后再依次计算ES值，如此重复一千次，得到一千个ES值，我们根据这一千个ES值的分布，来计算A.ES在这个分布中所处的位置及出现在该位置时的概率即得到了p值 。依次分别计算每个通路的ES及p值，然后使用多重检验矫正得到每个通路的FDR
此外，对于多个样本或多组样本，也可以利用T检验或方差检验对结果进行p值的计算与相应的FDR值。
以上即是整个ssGSEA算法的整体思路。
