Cas9蛋白包含的HNH核酸酶结构域负责切割外源DNA与间隔序列互补的链，而RuvC结构域负责切割外源DNA的另一条链。
而且Cas9蛋白可以方便地将核酸酶改造为切口酶（nickase）。只需要在Cas9蛋白中引入一个单氨基酸突变（D10A），核酸切割域的功能就变为切割单链DNA，能够更精确地控制CRISPR /Cas9系统的打靶效果，大大降低脱靶的概率。