必须筛选保护菌株
内切酶能够切割DNA，极易损伤细胞，因此在内切酶表达之前，首先要对表达的菌株进行筛选保护。
种类繁多且技术细节不透明
蛋白也许功能有类似处，但来源不同，性质不同；大多数内切酶研发信息不清晰，许多序列未知，带来了极大的研发难度。
纯化难度极大
采用标签纯化的内切酶，纯度难以保证，极易出现星号活性；想要获得高纯度的内切酶，必须采用无标签纯化技术，每个内切酶至少需要4步纯化来获得，难度加倍。
对单杂残留的要求高
内切酶切割后的DNA，往往形成极其不稳定的黏性末端，如果溶液中存在微量的污染（微量单杂），黏性末端会被部分或全部降解，直接导致后续实验失败。
总之，每个内切酶都是那么个性，个性到一酶一特质，一酶一方法。
为什么做好内切酶那么难
