在对抗恶性程度极高的
小细胞肺癌（SCLC）的征程中，放射治疗（RT）是重要的武器之一，但其疗效常因肿瘤的快速增殖和耐药性而受限。开发有效的放射增敏剂，成为提升患者生存率的关键突破口。多伦多大学特梅蒂医学院和玛格丽特公主癌症中心的Benjamin H. Lok博士团队利用前沿的CRISPR敲除文库筛选技术，系统性地从海量基因中发现了全新的放射增敏靶点—HDAC3。这项突破性研究不仅阐明了HDAC3通过调控染色质可及性与DNA损伤修复来影响放射敏感性的全新机制，更彰显了大规模、高通量的CRISPR文库筛选在现代靶点发现中的决定性力量。海星生物（HySigen） 作为提供专业CRISPR文库筛选与基因编辑服务的领先者，正是此类前沿探索得以实现的重要技术引擎。
一、核心研究方法
1. CRISPR文库筛选体系
· 细胞模型：选用SBC5人小细胞肺癌细胞系作为筛选模型，该细胞系在临床相关放疗剂量下具有稳定的增殖和存活特性，适合进行靶向筛选。
· CRISPR敲除文库选择：采用定制化EpiDrug sgRNA文库，涵盖可成药靶点及多个表观遗传调控因子，共靶向多个关键通路基因，通过慢病毒介导转染SBC5细胞。
· 筛选流程：细胞转染文库后，给予临床相关剂量放疗（IR），收集细胞量化sgRNA丰度，利用DrugZ算法分析差异富集基因，筛选放疗增敏候选靶点为HDAC3（图1A、B）。
2. 功能验证体系
· 遗传验证：构建HDAC3 shRNA介导的敲低（KD）细胞系（SBC5、H1048、H446、SHP77），通过免疫印迹验证HDAC3敲低效率及组蛋白乙酰化水平（图1C）；构建HDAC3野生型（WT）和去乙酰化酶活性缺失突变体（K25A）的回补细胞系，验证酶活性的必要性（图1E）。
· 药理学验证：使用HDAC3特异性抑制剂RGFP966，在多个SCLC细胞系中验证其放疗增敏效果（图1F、G）。
· 机制探究：结合ATAC-seq（染色质可及性）、γH2AX焦点检测（DNA双链断裂）、DNA双链断裂（DSB）修复报告基因测定（NHEJ、HR通路）、Western Blot（DNA损伤修复蛋白）等技术。
· 体内验证：在SBC5和H1048异种移植（CDX）小鼠模型中，评估HDAC3敲低或RGFP966联合放疗的抗肿瘤效果。
图1.体外对SBC5细胞的CRISPR敲除文库筛选确认HDAC3为SCLC中新型放射敏候选物
二、核心研究结果解析
1. HDAC3缺失通过增加染色质可及性
对照细胞、HDAC3敲低细胞及RGFP966处理细胞进行ATAC-seq，发现HDAC3功能缺失导致全基因组染色质可及性显著增加，尤其是基因启动子区域，提示HDAC3 通过调控启动子区域染色质状态影响基因转录（图2）。
图2.HDAC3功能丧失增加了染色质的可及性
2.HDAC3缺失损害DNA损伤修复，导致损伤持续存在
· 修复动力学：HDAC3功能缺失的细胞，其γH2AX焦点清除速度显著慢于对照，在48小时后仍有大量损伤持续存在（图 3A, B）；
· 抑制DSB修复通路：HDAC3 抑制显著降低 c-NHEJ（57.9%）、m-NHEJ（57.3%）和 HR（71.1%）的修复活性，同时下调 p-DNA-PKcs（NHEJ关键蛋白）和RAD51（HR关键蛋白）的表达，p-ATM（损伤信号）水平升高（图3C-F）；
· 协同治疗：由于DNA修复能力全面受损，HDAC3缺陷的SCLC细胞对PARP抑制剂（奥拉帕利Olaparib，他拉唑帕利Talazoparib）的敏感性增加，两者联合显示叠加至协同的杀伤效果（图 3G, H）。
图3. HDAC3功能缺失的细胞中，DNA DSB的生成和持续增多，且DSB修复功能受损
3.体内实验证实HDAC3靶向治疗的放射增敏潜力
· SBC5模型：HDAC3敲低本身能抑制肿瘤生长，与放疗联用后，肿瘤生长抑制（TGI）效果和动物生存时间均得到显著且大幅度的提升（图 4A）。
· H1048模型：RGFP966单药效果有限，但与放疗联用后，同样产生了显著的放射增敏和肿瘤控制效果（图 4B）。肿瘤组织检测证实了药物对HDAC3的抑制（H3K9K14ac升高）（图 4C）。
图4.HDAC3功能丧失与IR的结合改善了SCLC异种移植模型中的肿瘤控制
二、研究意义
该研究通过CRISPR文库筛选首次鉴定HDAC3为SCLC放疗增敏新靶点，明确其通过增加染色质可及性、加剧放疗诱导的DNA损伤并抑制DSB修复（NHEJ和HR通路），最终增强肿瘤细胞放疗敏感性的分子机制，为SCLC放疗增敏治疗提供了全新策略。研究同时证实，HDAC3抑制剂与PARP抑制剂具有协同作用，为联合治疗提供了理论依据。
CRISPR文库筛选作为发现关键靶点的核心技术，其高效性和无偏倚性在本研究中得到充分体现。海星生物（HySigen）的CRISPR文库筛选服务，依托自主研发的CRISPRSeek™平台，可提供定制化sgRNA文库设计与构建，涵盖全基因组文库、可成药基因文库、表观遗传调控因子文库等多种类型，技术流程覆盖sgRNA设计、慢病毒包装、细胞转染、高通量测序及数据深度分析，确保快速锁定关键功能基因。
参考文献：Patel U A, Shi M Y, Kazan J M, et al. CRISPR Screen Identifies HDAC3 as a Novel Radiosensitizing Target in Small Cell Lung Cancer[J]. Molecular cancer therapeutics, 2025: OF1-OF13.
技术服务：CRISPR/Cas9细胞基因编辑、CRISPR文库筛选/文库病毒/载体构建、分子诊断参考品/突变基因参考品/融合基因参考品、细胞稳转 / 细胞干扰
细胞试剂：HyCyte®干细胞/原代细胞/细胞株、三系诱导培养试剂、细胞专用培养基、基因编辑试剂盒、病毒现货、预筛选胎牛血清
