一、增殖

表型的最大特点就是可以通过特定的实验手段进行检测

研究层次：人群→动物→组织→细胞→分子

1、分子层面：MCM，PCNA，Ki-67

①直接相关：免疫组化（最常用）PCNA、Ki67（较特异地存在增殖细胞中,但Ki67 G1期不存在，营养缺乏时表达上升；PCNA，由于“DNA修复”误认为是“增殖”），PCNA、Ki-67、MCM（MCM最优）；

微小染色体维持蛋白，minichromasome maintenance protein，MCM，只在细胞的增殖期才能够检测到，它的表达在G1/S转换点达到峰值，在分化期和静息期时，表达缺失

Ki-67，细胞核相关抗原，在细胞的G0期不表达，G1中期到后期出现表达，S期和G2期表达逐渐增加，有丝分裂期达到高峰

PCNA，增殖细胞核抗原，周期素，参与DNA损伤的修复和间接参与细胞周期的调控，P21是CDK的抑制因子。在G0/G1期几乎没有表达，G1晚期表达大幅度增加，S期达到高峰,G2/M期表达下降。

②间接相关：检测肿瘤干细胞分子marker（如胰腺癌干细胞的CD44），存在争议，锦上添花；

拓展：干细胞检测实验 “干细胞悬浮成球试验”（microsphere formation assay），能在离体条件下，形成微球/悬浮球（microsphere），是鉴定具有干性细胞的方法和指标之一。

检测抑癌基因，最常见P53，PTEN表达水平下降（western、qPCR），提示肿瘤恶性程度上升，增殖表型↑

2、细胞层面：

MTT法；原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞没有这个现象。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，最后用酶标仪在特定的波长处，测定光吸收值，可间接反映活细胞的数量。在做MTT实验的时候，通常取5个时间点（通常就是5天）。把5天中每一天的吸光度数据都记录下来，最后形成一条细胞增殖的曲线。通过比较不同处理方式或者不同实验组之间，细胞增殖曲线的高低，就可以判断细胞增殖情况的快慢。

CCK8法：MTT衍生，原理类似

BrdU染色法；BrdU是胸腺密啶的衍生物，可以标记活细胞中新合成的DNA，可以代替胸腺嘧啶，选择性地整合到复制细胞新合成的DNA 中。Brdu特异性抗体+免疫荧光染色可以用于检测Brdu在细胞DNA中的渗入，从而判断细胞增殖能力/动力（影像）的变化。

Edu染色法：；BrdU衍生，原理类似

RTCA法（real time cell analyzer），实时细胞分析仪，利用RTCA实时细胞分析仪，当细胞在孔内发生粘附，转移，增殖的时候，孔内的电阻抗发生变化，被电极实时记录，研究者也就获得了相关的实时数据。采用这种RTCA的方法，不仅仅可以用于细胞增殖的数据的获取，也可以用来检测细胞的黏附、凋亡、转移等等，应用范围广；

RTCA 是实时记录，实时记录的好处就是，不仅能够获得关键时间点的细胞增殖数据，而且还可以获得在整个培养周期内的细胞增殖动力学变化过程

克隆形成实验（不常用）：以评估肿瘤细胞的离体增殖能力的大小以及肿瘤在体外的致瘤能力的大小；

干细胞悬浮成球实验

3、组织层面：降低维度，回到细胞生物学和分子生物学层面免疫组化；形态学，检测细胞形态和组织结构上的差异。但是从总体而言，从石蜡样本当中，能够获得mRNA和蛋白的可能性很小，但是通过石蜡样本可以获得比较好质量的DNA样本和miRNA样本。！注意区分肿瘤区域和癌旁区域！存放于深低温冰箱（-80 度）中的新鲜组织样本只要保存方法合适，是可以从新鲜组织样本中获取蛋白，或者是mRNA/lncRNA样本，可以用于后续的western实验或者qPCR 的实验。

4、动物层面：移植瘤动物模型，肿瘤大小、体积、重量 反映增殖最直观的数据；组织形态：移植瘤的中心部分形成部分组织和细胞的坏死，移植瘤恶性增殖程度越高，移植瘤内部形成坏死的区域也会愈加的明显。降低维度，匀浆后检测蛋白水平（western）、RNA（实时定量PCR）等；石蜡切片可获得高质量的DNA和miRNA样本，注意区分肿瘤区域和癌旁区域。

有了动物模型的移植瘤样本之后，检测增殖相关的分子标志物，可以有多种方法。

第一种常见的方法是，把移植瘤的样本，通过匀浆的方式抽提总的蛋白或者是总的RNA，检测增殖相关的分子标志物蛋白水平的变化或者是RNA水平的变化。检测蛋白可以用western blot；检测RNA水平的变化，可以用实时定量PCR的方法。如果对于移植瘤样本，不进行匀浆，不抽提总蛋白或者总的RNA，而是对移植瘤样本进行组织切片，然后通过免疫组化的方法，检测切片样本当中，PCNA 以及Ki-67 等增殖相关分子标志物的表达变化，也能达到类似的效果。

在移植瘤的样本当中，还可以检测细胞的组织形态。因为肿瘤细胞会发生不受控制的恶性增殖，会导致移植瘤的中心部分，由于肿瘤细胞的密度过高，无法接触到外界的氧气和养分，会使移植瘤的中心部分形成部分组织和细胞的坏死。移植瘤恶性增殖程度越高，移植瘤内部形成坏死的区域也会愈加的明显。所以可以通过移植瘤的组织切片，检测移植瘤内部坏死区域的面积大小，评估肿瘤恶性增殖程度的强弱。

总结：

增殖是最常见的表型，可以从分子/细胞/组织/动物 四个层面上进行相关检测。

在分子层面上，常见的有三个PCNA，Ki-67 和MCM。还有两类和增殖间接相关的分子标志物：一类是干细胞相关的分子标志物；另一类是检测抑癌基因，但相对不太常用。

缺点：Ki67在G1期不存在，营养缺乏时表达上升；PCNA，由于“DNA修复”误认为是“增殖”

在细胞层面上，常见的方法有：1）MTT 比色法；2）Brdu 染色法；3）RTCA（real time cell analyzer，实时细胞分析法），其中MTT比色法和Brdu染色法是经典方法，RTCA 对于硬件设备的要求很高，成本高昂。检测克隆形成，可以使用克隆形成实验（colony formation assay）。

MTT原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒。

RTCA不仅仅可以用于细胞增殖的数据的获取，也可以用来检测细胞的黏附、凋亡、转移等等，应用范围广。

在组织层面上，1）可以通过免疫组化的方法，检测增殖相关的分子标志物（PCNA，Ki-67 和MCM）；也可以取新鲜组织做western或qPCR，但注意区别肿瘤区域和癌旁区域；2）通过形态学，检测细胞形态和组织结构上的差异。

在动物层面上，检测增殖表型最常用的动物模型是移植瘤动物模型，记录移植瘤的大小/体积，重量等参数。通过动物的移植瘤样本，同样可以检测增殖相关的分子标志物。另外，由于移植瘤中，细胞发生急剧的增殖，会导致移植瘤内部因为缺少氧气和养分而形成坏死区域，通过形态学检测移植瘤内部的坏死区域，也是评估增殖的有效手段。