导读
在该研究中，研究者首先对最新的诱导契合对接技术 IFD-MD 进行了回溯验证。选取公开的 GPCR 实验结构作为验证对象，研究显示 95%的交叉对接产生的构象在前两个预测中的配体 RMSD ≤ 2.5 Å。
随后，研究者将 IFD-MD 和 FEP 方法应用于 AlphaFold 模型的生长抑素受体家族 GPCRs。所使用的 AlphaFold 模型是在该家族任何实验结构公开之前生成的。
通过 FEP 验证，研究者为 SSTR2、SSTR4 和 SSTR5 建立了模型，均方根误差约为 1 kcal/mol。
此外，还探讨了在有限配体数据、充足配体数据和分类数据情况下模型验证的挑战。
从公共数据库中精选 GPCR 结构
获取并过滤数据
研究从 GPCRdb2 和 RCSB PDB Bank 提取配体结合的 GPCR 结构。一个关键步骤是使用 A2A 受体（PDB ID 6wqa）作为基准，筛选出那些缺乏如正交位结合口袋中的配体等重要特征的结构，或那些分辨率低于 3.5 Å 的结构。
准备交叉对接
接下来的阶段涉及按它们的 Uniprot ID 对处理后的结构进行分组，然后对结构对的配对组合进行复杂分析。这一步对理解不同配体和受体之间的相互作用至关重要。
使用 Schrödinger 的 PrepWizard 工具加入氢原子并定义质子化状态，最终选出 10 种不同 GPCR 中的 82 对配对。
IFD-MD
IFD-MD 工作流的初始步骤
IFD-MD 工作流是一个创新的双部分过程。前半部分采用隐式溶剂方法，结合药效团对接、刚性受体对接和结合位优化。一个聚类步骤确保了所得 20 个候选构象的独特性。
IFD-MD 的高级阶段
后半部分，该工作流涉及每个构象 500 ps 的 MD 模拟，通过使用 WScore 的评分过程进一步细化。前五名构象经历 10 ns 的结合构象超分子动力学试验，以评估不同结合模式的稳定性。如果观察到显著偏差，将进行延长的 100 ns MD 模拟以达到收敛。
纳入膜蛋白
在作者的研究中一个显著的修改是在模拟期间包含了膜的显式表示。这一调整对膜蛋白至关重要，因为它提供了更真实和准确的建模环境。
在 GPCR 研究中评估 AlphaFold 模型
案例研究: 生长抑素受体家族
研究者利用生长抑素受体家族缺乏实验结构的情况，测试 AlphaFold 模型的有效性。通过将我们的模型与新报告的实验结构进行比较，获得了关于计算模型预测 GPCR 结构能力和局限性的研究结论。
数据集构建和分析
评估涉及来自各种出版物的多样化数据集，每个都呈现独特挑战。这些数据集的范围从大型、高质量数据集到小型或质量较低的数据集，为评估我们模型的预测力提供了全面的基础。
主要结果
- 🧬 选取 SSTR4 的数据集
- 📈 应用 AlphaFold 模型和 IFD-MD 算法
- 🧪 验证模型的准确性
研究者基于综合了大量配体数据和高质量实验结合亲和力测量数据，对 SSTR4 模型进行了深入研究。
首先，作者从 AlphaFold 模型中筛选出五个初始结构，并对其进行分子对接计算，最终选出五个评分最高的分子对接模型。这一过程中，研究者使用了特定的模板配体来定义结合位点，并为早期的构象提供药效团模型。
随后，利用 Schrödinger 的 FEP+软件包预测了配体同系列中蛋白质-配体结合的亲和力。在对 25 个模型进行 FEP 测试后，发现仅有三个模型的均方根误差接近 1 千卡/摩尔。该研究还涉及使用 PDB ID 7XMT 作为分子对接输入结构，对 18 个配体的 6-6 环系列进行 FEP 性能评估。
最终，AF5 和 IFD1 模型被认定为最优和最终模型，它们成功预测了配体与受体间的盐桥和其他氢键相互作用。完成 SSTR4 模型后，作者进行了物理分析，包括与原始 AlphaFold 模型的对比。
文章最后探讨了 SSTR2 和 SSTR5 的建模挑战，以及如何使用 FEP 验证结构预测。
图 1： 对 10 个靶标的 82 个分子对接实验进行的回顾性 GPCR 性能分析。
标准成功定义为在前两个预测中，配体的 RMSD 达到 2.5 Å 或更佳。
图 2： SSTR4 模型的模板配体与靶配体比较。
- （A）Mazzaferro 等人专利公告中所含 SSTR4 配体数据集的马库什结构示意图。
- （B）SSTR4 6−6 子系列中最有效配体，也是诱导契合对接-分子动力学（IFD-MD）初始靶配体。
- （C）从 PDB ID 4N6H 提取的 δ-阿片类结构模板配体纳曲酮。
图 3： 最终 SSTR4 模型预测的 ΔG 与实验 ΔG 的对比。
该模型包含所有 64 个配体，结合了 5−6 和 6−6 环状子系列。其 R^2^为 0.54，RMSEpairwise为 1.00 (千卡/摩尔)。图中每个点的具体值在表 S6 中报告。
图 4： 专利申请中最有效的配体 27 的最终预测结合模式。
图中虚线表示配体与其他分子的氢键关系。配体 27 与 D1263.32 形成盐桥，S3007.42 和 Q2796.55 形成氢键，D1263.32 处还存在第二个水介导的氢键。
图 5： 最终预测的 SSTR4 配体结构（青色）与原始 AlphaFold 模型 5（粉色）的对比。
最显著的诱导契合效应体现在 L2977.39 的位置变动上。
图 6： 两个顶级 IFD-MD AlphaFold 模型的对比。
青色代表顶级模型（AF5, IFD1），粉色代表第三优模型（AF4, IFD2）。Y3017.43 周围的小螺旋倾斜导致配体稍远离口袋，使得配体 NH2 无法与 S3007.42 形成氢键。
图 7： 最终 AlphaFold-IFD-MD 结构（青色）与 7XMT-IFD-MD 结构（绿色）预测的结合模式比较。这两种结合模式之间的配体 RMSD 为 1.12 Å。
图 8： SSTR2 与配体 5o 结合的最终模型与 Contour-Galcér 等人 2005 年的研究比较。
- （A）从 PDB 7T11，一个 SSTR2 的冷冻电镜结构，生成的最终模型。
- （B）基于 AlphaFold 模型生成的最终模型。
图 9： SSTR5 与配体 1−77 结合的最终模型。
- （A）配体 1−77 的二维表示图。
- （B）1−77 配体在 SSTR5 中的结合模式。该模型展现了类似 SSTR4 模型的特征，包括配体酰胺与 D1193.32 之间的盐桥和水介导相互作用。
表 1： AlphaFold 模型基于 SSTR4 对 18 个含 6−6 融合环的亚系列配体进行的 IFD-MD 输出 FEP 性能评估
注：R² 为实验 ΔG 与预测 ΔG 之间的决定系数。RMSE pairwise 表示相对于实验中 FEP 值的所有配体对的相对自由能变化的均方根误差。
表 2： 完整的 5−6 和 6−6 亚系列在 6−6 亚系列模型所确定的顶级模型上的 FEP 性能
表 3： 最有效的 5−6 配体（示例 33）在 AB-FEP 模型中的预测 ΔG 与实验数据的比较
表 4： 使用 PDB ID 7XMT 作为起点的 IFD-MD 在 6−6 融合环亚系列中的 FEP 性能评估
表 5： 基于 RMSE 下限排名的前 10 个 SSTR5 模型的结果
注：RMSE 下限是基于 54 个配体对计算得出的。RMSD 到模型 1 是基于所有配体重原子，但排除了模型间位置显著变化的环丙基乙基组。目标配体为在相应 AlphaFold 模型中通过 IFD-MD 明确对接的配体。同系列的其他配体与对接该配体的 IFD-MD 输出对齐。
表 6： 作为构象采样量或分子截断程度函数的 pKa 预测比较
注：pKa 不确定性是基于三种不同输入构象计算得出的标准偏差。
讨论
- 🧬 结构基方法与实验数据相结合
- 🔬 克服实验数据的局限性
- 🧪 重视配体质子化和异构体状态
在结构基药物发现领域，联合应用 IFD-MD 方法和 FEP+计算是一种创新方式。研究者通过对 GPCR 药物靶标的回顾性研究，证实了这种方法的准确性和强大的适用性。研究首先利用 AlphaFold 或实验结构确定的方式，获取候选受体结构的初始集合，随后结合同系列药物的实验结合亲和力数据，通过 FEP 计算来验证这些结构模型。不同的诱导契合构象可能对不同的药物同系列都是必需的。
实验数据的局限性同样是研究中的关键议题。例如，在 SSTR2 的研究中，由于配体数量有限，无法准确确定正确的结合模式。然而，研究者可以通过合成和测试更多的化合物来克服这一限制。另外，在 SSTR5 的研究中，由于缺乏准确的结合亲和力测量，仅有的配体分类造成了另一种形式的限制。
对于配体的正确质子化和异构体状态的评估，在得出可靠结论方面至关重要。例如，在 SSTR4 数据集中，使用 Jaguar Macro pKa 算法计算草酮氮的 pKa 并非直观。在不同 pKa 计算方法下，作者选择了最极端的截断方式，这种方法对 SSTR4 配体系列具有普遍适用性。
参考资料:
Coskun, D., Lihan, M., Rodrigues, J. P. G. L. M., Vass, M., Robinson, D., Friesner, R. A., & Miller, E. B. (2023). Using AlphaFold and Experimental Structures for the Prediction of the Structure and Binding Affinities of GPCR Complexes via Induced Fit Docking and Free Energy Perturbation. Journal of Chemical Theory and Computation.
https://doi.org/10.1021/acs.jctc.3c00839 IF: 5.5 Q1 B1
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