Nature | 病毒衍生肿瘤相关抗原识别和表征肿瘤反应性CD8 T细胞

原创 huacishu图灵基因今天

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：huacishu

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亮点：

1、研究表明在HPV阳性HNSCC患者中存在对PD-1定向免疫治疗有反应的细胞机制。

2、本研究表明E2和E5是HPV阳性HNSCC患者肿瘤内CD8 T细胞反应的主要靶点。

3、对HPV阳性HNSCC患者CD8 T细胞反应的研究，可以作为其他病毒介导癌症免疫反应分析的基准。

美国埃默里大学Winship癌症研究所Rafi Ahmed教授团队在国际知名期刊Nature在线发表题为“Functional HPV-specific PD-1+stem-like CD8 T cells in head and neck cancer”的研究论文。慢性病毒感染和癌症导致CD8 T细胞功能受损，其特征是多种抑制性受体（包括PD-1）的表达。阻断PD-1抑制途径可增强T细胞功能，是多种癌症的有效治疗方法。临床前研究表明，一种独特的PD-1+TCF-1+干细胞样CD8 T细胞亚群在慢性感染期间维持CD8 T细胞反应，并在PD-1定向免疫治疗后提供源源不断的增殖。在人类肿瘤中也发现了类似的PD-1+TCF-1+CD8 T细胞。然而，需要更好地定义其抗原特异性及其与肿瘤中其他CD8 T细胞亚群的谱系关系，以了解人类癌症中的T细胞分化途径并优化免疫治疗方法。本研究通过分析头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中HPV特异性CD8 T细胞来解决上述问题。

为了研究CD8 T细胞对HNSCC的反应，从未接受治疗的HPV阳性HNSCC队列中的12名患者的6个原发肿瘤和8个转移淋巴结中鉴定了TIL。通过流式细胞术检测，CD8 T细胞约占TIL的30%（图1a）。大多数CD8 TIL表达高水平的PD-1，所有PD-1+细胞均为CD45RA阴性（图1a）。这些PD-1+CD45RA−CD8 T细胞包括表达TCF-1或TIM-3的不同群体（图1b），这些标记通常用于区分干细胞样细胞（TCF-1+TIM-3−) 和终末分化（TIM-3+TCF-1−) PD-1+CD8T细胞。虽然患者之间差异很大，但平均45%的PD-1+细胞表现出终末分化表型。所有患者均存在干细胞样PD-1+TCF-1+CD8 T细胞，与TIM-3+细胞相比，其颗粒酶B、Ki-67和CD39的表达水平显著降低（图1b）。这两个亚群都表达TOX，TOX是慢性病毒感染和癌症期间CD8 T细胞分化的关键转录因子。接下来，使用多重免疫组织化学方法检查了原发性肿瘤和转移性淋巴结中这些PD-1+CD8 T细胞亚群的解剖位置。CD8+和PD-1+细胞广泛存在于细胞角蛋白阳性的肿瘤实质以及肿瘤周围的基质中（图1c）。值得注意的是，PD-1+TCF-1+细胞主要存在于间质区域，很少出现在肿瘤实质中（图1d，e），而分化程度较高的细胞则分散在肿瘤微环境（TME）中，这表明干细胞样细胞位于TME内，远离肿瘤本身。

HPV阳性HNSCC提供了使用一组确定的病毒衍生肿瘤相关抗原来识别和表征肿瘤反应性CD8 T细胞的机会。作者重点研究了已知的HPV癌基因E5、E6和E7，以及参与HPV基因组表位维持的E2。为了鉴定HPV衍生的CD8 T细胞表位，使用251个预测的HPV培养HNSCC患者的外周血单个核细胞（PBMC）2周，然后使用干扰素-γ（IFN-γ）酶联免疫吸附斑点（ELISpot）检测扩增的PBMC中T细胞的反应性（图2a，b）。总的来说，ELISpot鉴定出43种不同的肽（22种HPV E2肽、10种HPV E5肽、9种HPV E6肽和2种HPV E7肽），多个患者的T细胞可识别多个表位。通过对从原发性肿瘤和转移性淋巴结分离的TIL进行四聚体染色，可以在体外检测到HPV特异性CD8 T细胞，并且所有这些细胞都表达高水平的PD-1（图2c）。不同患者之间HPV特异性CD8 T细胞的频率不同，从CD8 TIL的0.1%到10%不等，但在同一个体的原发肿瘤和转移淋巴结中，CD8 T细胞到给定表位的频率相似（图2c，d）。总之，这些数据表明，在HPV阳性的HNSCC中，HPV特异性CD8 T细胞可以占CD8 TIL的很大比例，并且尽管具有相同抗原特异性的细胞可以从PBMC中扩增出来，但在稳态条件下，它们在血液中的频率要低得多。

从7例原发性肿瘤和6例转移性淋巴结中分离出HPV四聚体阳性CD8 TIL，并通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）检测其转录特征。HPV特异性CD8 TIL由三个转录不同的集群组成，在数百个基因的表达上彼此不同（图3a）。所有的集群表达TOX-a转录因子，该转录因子对于在T细胞和抑制分子PDCD1、CTLA4和TIGIT中建立表观遗传状态至关重要（图3b）。集群1细胞的特征是TCF7的高水平表达，TCF7是慢性病毒感染期间产生干细胞样CD8 T细胞所必需的转录因子。集群1细胞也表达LEF1，另一种与干细胞样T细胞相关的转录因子；T细胞存活所需的IL7R；CCR7，参与淋巴组织归巢的主要受体；以及XCL1和GPR183（EBI2），这两种分子与树突状细胞的迁移和募集有关。集群2中的HPV特异性CD8 T细胞的特征是PRDM1和几种其他转录因子的高表达，这些转录因子通常与急性T细胞受体（TCR）结合有关，如NR4A1（NUR77）、FOS和JUN，表达最高水平的IFNG。在集群2和集群3中发现效应分子如GZMA、GZMB、PRF1和GNLY的表达，并且这些集群还表达抑制性受体如HAVCR2（TIM-3）和ENTPD1（CD39）。上述分析包括来自不同患者、来自原发和转移部位的HPV特异性CD8 T细胞，以及不同的表位特异性。对HPV特异性CD8 TIL的单独分析显示，这些细胞在已识别的集群中的分布具有可比性，与样本来源和表位特异性无关（图3c）。此外，将HPV特异性CD8 TIL与原发性肿瘤和转移性淋巴结分开聚集，可产生具有可比性的集群，相应集群之间的基因表达差异最小，表明HPV特异性CD8 TIL在原发和转移部位的分化状态非常相似。HPV特异性PD-1+CD8 TIL的流式细胞术分析进一步证实TME中存在TCF-1+干细胞样细胞和更多终末分化细胞，TCF-1+细胞表达高水平的CD28和低水平的颗粒酶B和TIM-3。

HPV特异性CD8 TIL的TCR序列显示每个四聚体的TCR克隆型占优势。来自个体患者原发和转移部位的配对scRNA-seq数据显示，两个部位的特定克隆型频率之间存在相关性。最重要的是，HPV特异性CD8 T细胞在三个集群之间显示出显著程度的TCR克隆重叠（图4）。事实上，在干细胞样、暂时性和终末分化的HPV特异性CD8 T细胞中，最显性和不太显性的克隆型分布相似。研究分析的所有HPV特异性四聚体分类的CD8 T细胞都出现了这种情况。

为了提供所提出的谱系关系模型的直接实验证据，检测了HPV特异性PD-1+干细胞样细胞和终末分化的CD8 T细胞在体外用同源HPV肽刺激后增殖和分化的潜力。直接从肿瘤中提取TIL，用细胞追踪紫罗兰（CTV）标记，然后根据表面标记物PD-1、TIM-3和CD39的表达，通过流式细胞术将CTV标记的CD8 TIL分类为干细胞样（PD-1+TIM-3−CD39−) 和终末分化（PD-1+TIM-3+CD39+）CD8 T细胞（图5a）。然后，将两个分类的PD-1+亚群在患者匹配的自体PBMC中培养五天。在缺乏HPV肽的情况下，从肿瘤中分离出的干细胞样或终末分化的CD8 T细胞几乎没有增殖（图5b）。然而，用HPV肽刺激干细胞样细胞导致HPV特异性四聚体阳性CD8 T细胞的广泛增殖，这些细胞经历多达七次分裂。相比之下，只有极少数当用相同的肽脉冲PBMC刺激最终分化的HPV特异性CD8 T细胞时，未观察到增殖（图5b）。通过复制指数测量的所有七个样本均观察到HPV特异性干细胞样CD8 T细胞的优越增殖能力（图5c）。这些结果清楚地表明，肿瘤中存在的HPV特异性PD-1+干细胞样CD8 T细胞具有增殖潜能，而分化程度更高的HPV特异性CD8 T细胞在抗原刺激后已丧失分裂能力。接下来，研究了抗原诱导的HPV特异性干细胞样CD8 T细胞增殖是否与分化为更多终末分化细胞有关。在没有抗原刺激的情况下培养的干细胞样CD8 T细胞表达低水平的TIM-3、颗粒酶B和CD39，因此维持其体内表型（图5d）。然而，用同源HPV肽刺激这些HPV特异性干细胞样CD8 T细胞导致四聚体阳性增殖CD8 T细胞显著上调TIM-3、颗粒酶B和CD39（图5d）。值得注意的是，HPV特异性PD-1+干细胞样CD8 T细胞表达CD45RO亚型，与基于CD45RA表达定义的人类干细胞样记忆CD8 T（TSCM）细胞不同。

该研究结果主要在三个方面有意义：第一，基于PD-1的HPV阳性HNSCC患者治疗；第二，对于HPV治疗，预防接种策略；第三，病毒介导的癌症。首先，研究表明在HPV阳性HNSCC患者中存在对PD-1定向免疫治疗有反应的细胞机制。在这些患者的肿瘤中很容易检测到功能性HPV特异性PD-1+TCF-1+CD8 T细胞，在抗原刺激后可增殖并分化为效应细胞样细胞。研究结果为进一步研究HPV阳性头颈癌PD-1靶向新辅助治疗和辅助治疗提供了有力的理论基础。第二，在为癌症患者开发治疗性HPV疫苗方面已经做出了相当大的努力，但这些研究大多集中于HPV E6和E7作为疫苗的靶抗原。本研究表明E2和E5是HPV阳性HNSCC患者肿瘤内CD8 T细胞反应的主要靶点。因此，针对HPV阳性E5作为疫苗抗原的患者的治疗性疫苗接种策略可诱导最大范围的肿瘤反应性CD8 T细胞反应。最后，必须强调，病毒介导的癌症是全世界的一个主要公共卫生问题。对HPV阳性HNSCC患者CD8 T细胞反应的研究，可以作为其他病毒介导癌症免疫反应分析的基准。

教授介绍

Rafi Ahmed教授是美国国家科学院院士，是世界著名的免疫学家，长期致力于记忆性T细胞的分化，T细胞及B细胞的抗病毒免疫机制的研究。Rafi Ahmed教授研究的长期目标是了解B细胞和T细胞免疫记忆的机制，并利用这些信息开发预防和治疗疾病的新疫苗。Rafi Ahmed教授实验室近期的一项重大突破表明，急性和慢性病毒感染期间，记忆CD8 T细胞分化存在显著差异，从而确定抑制性受体PD-1是慢性感染期间T细胞功能障碍的主要介质。这项工作已直接转化为人类临床研究，其中PD-1抗体阻断剂已用于治疗慢性感染和癌症。以通讯作者在Nature, Science, Cell, Nature immunology, Immunity杂志上发表论文50多篇，是CD8+ T细胞领域的专家。。

参考文献

Eberhardt CS, Kissick HT, Patel MR, et al. Functional HPV-specific PD-1+stem-like CD8 T cells in head and neck cancer. Nature.2021;10.1038/s41586-021-03862-z. doi:10.1038/s41586-021- 03862-z