siRNA干扰实验流程

前言

在研究某基因的功能时,常常要用到某基因的过表达,或敲除,或敲低。

在敲除方面,常用的就是Crispir/Cas9技术,不过此技术周期比较长,步骤比较麻烦,就我们实验室而言,做的熟练的同学,最快也得需要一个月。如果临时想要研究某基因的功能,例如某个miRNA的靶基因,想要敲低这个靶基因,通常会采用siRNA的方法,这种方法速度比较快,从下订单到实验结束,最快需要两周(公司合成通常是一到两周),但成本比较高,这里总结一下siRNA的实验方法。

转染siRNA有很多方法,有国内公司的转染试剂(例如锐博),也有常规进口的,例如Lipo2000或Lipo3000,这里只介绍一下QIAGEN的HiPerFect(因为我觉得这种最方便)。

试剂

HiPerFect转染试剂(QIAGEN,货号:301705)
OPTI-MEM(ThermoFisher,货号:31985-062)
siRNA储备液(20uM,广州锐博)

试剂配置

siRNA的订制

siRNA是一段寡枋苷酸片段,直接向公司订制即可,周期通常是1到2周。以锐博公司为例,从公司订回来的siRNA通常包括5条,1条装一管,分别是目的基因的3个(公司会保证至少有1条能敲除目的基因),1条是针对Actin的,这是阳性对照,一条是Negative Control(NC),阴性对照。

siRNA的分装

一管通常是5nmol,需要配置为20μM的储备液,那么5nmol需要加无菌水250μL。配置结束后,需要分装,装到200μL的EP管中,为了避免反复冻融(有的时候反复冻融也有效果,,但不建议这么做)。每管装10μL或5μL,使用的时候,拿出适当的剂量即可,例如我要转染的细胞是铺在6孔板中,siRNA的终浓度是50nM,那么1个孔中就需要加5μL的siRNA储备液,此时拿出一管即可。

实验流程

这里以转染RAW264.7细胞为便说明一下,以下实验步骤均参考自QIAGEN的说明书,并且本人已经进行了验证。

  1. 提前一天将RAW264.7细胞铺在6孔板中,细胞数目为2.5x105个/孔,培养基体积为2300uL。

  2. 次日,取将20μM的siRNA储备液(如果转染的是miRNA mimics,也是如此)5uL加到83uL的不含血清的培养基中(通常是OPTI-MEM培养基),5μL的siRNA加到6孔板的1个孔时,孔中的终浓度是50nM,随后在上述混合液中加入12uL的HiPerFect转染试剂(货号:QIAGEN官网参考资料中推荐了不同的浓度,一份是说加6uL,一份是说加12uL,这里加12uL),混匀即可,此时总体积为100uL。

  3. 在常温下孵育5到10min。

  4. 将上述的转染复合物逐滴加到6孔板中,轻轻混匀。

  5. 将细胞培养板放到孵箱中,在24到72小时后检测基因表达量(我觉得等细胞长到80%密度的时候就行,这个时间大概是48到72小时。

  6. 检测基因的敲低效果,就是WB,这个是金标准,毕竟最终目标是蛋白,这里不建议采用RT-qPCR的方式检测敲低效率,有的时候mRNA变化并不明显,但蛋白水平会明显降低(除非转染的是miRNA或lncRNA的siRNA这些非编码核酸,只能RT-qPCR方式进行检测)。

注:《HiPerFect Transfection Reagent Handbook》中提到,在24孔板中转染RAW264.7时,流程跟上面有所出入,先是细胞用100uL的培养基加到24孔板中,再加siRNA,再加HiPerFect,放到孵箱中孵育,6小时后,再补充400uL的培养基,这种方式没有验证过,不推荐。

参考资料

  1. Quick-Start Protocol HiPerFect®Transfection Reagent
  2. Fast-Forward Transfection of RAW 264.7 cells with miRNA/miRNA inhibitor using HiPerFect Transfection Reagent
  3. HiPerFect Transfection Reagent Handbook
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