背景介绍
一、什么是BSA?
BSA（Bulked Segregant Analysis）---混合分组分析法
>根据目标性状表现型，对表型分离群体中的个体/株系依据目标性状，分成性状差异显著的两组
>然后将两组的个体或株系DNA分别等量混合，形成性状相对的DNA混合池。
>再然后建库、测序、分析的方法（根据亲本间纯和差异的位点，计算子代池的index值，进而挑选差异较大的位点
>可以实现目标性状的基因定位
二、BSA适应的群体类型
三、BSA分析的目的
通过对极端性状产生机理的研究与发展，完成家系材料单性状基因的定位，揭示性状相关机制，应用实际生产过程中， 达到育种期望，提高生产效益。
选择样本：极端亲本1和2；极端子代混池1和2
主要分析的内容：根据SNP/INDEL频率差异分析，确定与极端性状紧密相关的分子标记，并完成定位基因；目的基因功能注释。
四、生物信息分析流程
1、GATK 群call--vcf
2、变异位点注释
3、index计算
3.1 挑选亲本间纯合差异的位点
3.2 SNP-index的计算（极端亲本P1为参考，分别计算两个子代在亲本间上述标记位置上的SNP-index）
候选位点：挑选极端性状子代混池1（跟参考亲本性状相同）的SNP-index接近0，且子代2（与参考亲本性状相反）的SNPindex接近1的位点
3.3 选择1Mb为窗口，1kb为步长，计算每个窗口中SNP-index
4、目标性状的定位
对于候选的多态性标记位点进行ANNOVAR的注释，提取注释结果，优先挑选upstream或者引起stop loss或者stop gain或者非同义突变或可变剪接的位点所在的基因作为候选基因；
4.1. 外显子上的候选位点：
4.2.nonsynonymous的位点所在基因以及upstream相关基因：
5、目标基因的定位
五、流程回顾
六、常见问题
1、简化基因组BSA比全基因组BSA价格便宜?
答:简化基因组技术,捕获的基因组信息占基因组大小约1%~10%,全基因组技术,对至少25倍
2、简化基因组测序适合做BSA性状定位吗?
答:针对微效多基因控制的数量性状,与目标性状相关的位点很多,简化基因组或许有幸捕获到少数位点,但绝大部分会被遗漏,这对后续的研究很不利。针对质量性状或由少数主效基因控制的数量性状,简化基因组BSA的方法风险更高。全基因组BSA性状定位与简化基因组BSA性状定位见表2-1
3、子代混池的样品个数和测序深度如何设计?为什么?
答: 2013年, James等对混池个体数和测序深度对候选基因数的影响进行了评估。下图是评估结果,结果显示,当子代个数超过20个,测序深度达到25x以后,候选基因个数会趋于平衡,不会有更明显的提升效果。基于以上文章经验以及已完成的BSA项目经验,推荐20个个体进行混池,每池20×的测序深度。
4、DNA样品如何混池?先混样再提DNA?还是先提DNA再等量混合?
答:先提DNA再等量混合,可以减少系统误差,近年发表的多数文献都是先提DNA再等量混合。
5,能否只测亲本?或者只測子代池?或者只測1个子代池?
答:分两种情况:
1)如果研究的性状是EMS诱导的突变性状,可以只测两个子代池(野生型+突变型)或者测1个亲本(野生型)和1个子代池(突变型)。
2)如果研究的性状是数量性状,最好测2个亲本和2个子代池,用一个实际在线项目评估了样品个数对分析结果的影响,其中4个样品的结果最好(也即2个亲本+2个子代池),其次是测一个亲本和两个子代池,如果只测两个子代池,假阳性会很高,找出来的SNP很多(下表)。
6,能否保证定位到的候选区域的大小和候选基因的个数?
答:候选区域的大小和候选基因个数的多少,与群体的大小、亲本材料差异的大小、目标性状特点、测序深度的多少、分析物种的基因组水平等多项因素相关,因此不能给出统一的标准,但可以参考已完成的项目经验进行估计。
7,没有参考基因组的物种能否做BSA性状定位?
答:没有参考基因组的物种可以进行SNP频率差异分析,可以找到侯选这段,但是无参定位效果较差,并且缺少注释文件,获得的结果少无参物秤一般情况不推荐做BSA性状定位,建议尝试遗传图谱等方案。
8,多倍体物种可以进行BSA性状定位吗?
答:有参考基因组的多倍体物种,例如: “油菜",可以用BSA进行性状定位。
9, BSA性状定位可以利用InDel进行定位分析吗?
答:使用SNP标记进行定位的主要原因是SNP在基因组上的分布密度要比InDelSSR,SV,CNV等要高,使用SNP标记可以找到比较精确的区间。找到候选区间之后,可以对候选区间中的InDel和其他变异进行检测。直接利用InDel信息进行定位缺少文献支持,并且定位效果不如SNP效果好。
10,人工诱变只能是EMS诱变嘛?其他诱变方式得到的性状可否采用BSA性状定位?
答: BSA性状定位是基于SNP,通过比较SNP频率差异进行分析的, EMS诱发的是点突变,所以EMS诱发的突变适合这种分析方式;其他的诱变方式诱发的大部分是结构变异,在SNP水平上可能找不到导致目标性状差异的区域，所以不适合SNP频率分析的方法。
11,全基因组(WGS ) BSA性状定位与转录组(RNAseq )进行性状定位的比较。
答: 2013年,Henke等总结了全基因组BSA相比转录组( RNAseg进行性状定位的优点
1)覆盖范围:全基因组BSA可以覆盖整个基因组, 98%的编码区可以覆盖到。而RNAseq只对编码区进行测序。
2)基因检测的偏好性:全基因组BSA对基因的检测较均匀,无偏好性,不受时间或者组织的影响。RNAseq偏向于在特定时间或者组织中高表达的基因。
3)区域偏好性:基因分布不均匀,若一些区域基因密度低,用RNAseq可能漏掉。
4)多态性:基因组的多态性多数位于非编码区,采用RNAseq检测到的多态牲较低,只有少数与突变位点连锁的多态性标记能被RNAseq检测到。
因此,采用全基因组BSA更容易检测到与目标基因连锁的多态性标记。
后续更新。。。。。
QTL-seq（数量性状）
MutMap（点突变性状）
InDel-seq（InDel突变性状）
转录组BSA
