The differential immune responses to COVID-19 in peripheral and lung revealed by single-cell RNA sequencing | Cell Discovery

https://www.nature.com/articles/s41421-020-00225-2

影响因子： 6.255
PMID：33101705

期刊年卷：Cell Discov 2020;6 生物二区 细胞生物学 Q2 60/190

DOI：10.1038/s41421-020-00225-2

介绍

作者使用单细胞RNA测序，对未感染对照和COVID-19患者以及配对支气管肺泡灌洗液（BALF）中的细胞的外周血单个核细胞（PBMC）进行了表征。在这里，作者对来自同一COVID-19患者的配对外周血单个核细胞（PBMC）和支气管肺泡灌洗液（BALF）样本进行了scRNA-seq分析。作者的数据揭示了各种免疫簇的深刻变化，并描绘了COVID-19患者周围免疫麻痹和支气管肺泡免疫过度活化。

1. 作者发现树突状细胞(DC)减少和类似髓系抑制细胞(MDSCs)的单核细胞增加与重症新冠肺炎患者血液中淋巴细胞减少和炎症密切相关。MDSCs样单核细胞呈免疫麻痹状态。
2. 相比之下，新冠肺炎患者BALF中的单核巨噬细胞产生大量细胞因子和趋化因子，但分泌的干扰素很少。
3. 重症新冠肺炎患者外周血T细胞和NK细胞明显低于健康对照组，尤其是先天类T细胞和各种CD8T细胞亚群。
4. 相反，重症新冠肺炎患者T细胞亚群中各种活化的CD4T细胞亚群(包括Th1、Th2和Th17样细胞)的比例增加，并呈克隆性扩张。
5. 患者的外周T细胞未显示衰竭或细胞死亡增加的迹象，而BALF中的T细胞产生较高水平的IFNG，TNF，CCL4，CCL5等。
6. 成对的TCR追踪表明外周T细胞大量转移至重症患者的肺。

结果

1. 重症COVID-19患者外周免疫功能异常的概述

生成了由200,059个细胞组成的高质量scRNA-seq数据集，该数据集表征了来自三名健康对照（HC），五名轻度和八名重度COVID-19患者的外周免疫细胞（图1a）。这些患者的原数据在补充表S1中列出。轻度疾病患者在住院11–18天后全部cured愈出院，8例重度疾病患者中的2例死亡，而其他重度病例在住院12–58天后康复。此患者队列的临床过程类似于早先的报告，其中，老年患者基础疾病倾向于产生重度的症状和表现出较高的死亡率1，2，20。此外，重度患者的血浆白细胞介素（IL）-6和C反应蛋白（CRP）水平较高，而淋巴细胞计数却减少，这表明细胞因子风暴和淋巴细胞减少。

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图1：来自COVID-19患者的PBMC的单细胞分析

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聚类分析显示标记基因注释的29个簇和10种主要细胞类型，包括

T细胞（CD3D），

NK细胞（KLRF1），

B细胞（CD79A），

单核细胞（CD14，FCGR3A），

骨髓DC（mDC）（CD1C） ，

浆细胞样DC（pDC）（IL3RA）和

浆细胞（PC）（IGKC），

巨核细胞（MYL9），

cycling 细胞（MKI67）和

红细胞（HBB）（图1b，c和补充图S1a，b） 。

在随后的分析中不包括红细胞，并且基于特定标记将cycling 细胞重新分为cycling T细胞，cycling PC和cycling NK细胞（补充图S1d，e）。
与HC相比，COVID-19患者的外周免疫状况明显失调，尤其是在重度病例中（图1d）。
最显著的变化包括单核细胞和cycling T细胞的扩增以及NK，T和mDC群体的减少，从而导致COVID-19患者的单核细胞/ T细胞比率大大增加（图1e，f）。在重度COVID-19中，pDC的频率也降低了，尽管差异无统计学意义。这些数据加在一起表明，SARS-CoV-2感染极大地干扰了血液免疫细胞簇，特别是在那些患有重度疾病的患者中。

2 重塑COVID-19患者中的髓样细胞数量

为了进一步了解髓样细胞室的重塑，作者重新聚集了髓样细胞，并鉴定了五种不同的细胞类型，包括

CD14+经典单核细胞，

CD14+CD16+中间单核细胞，

CD16+非经典单核细胞，

DC1和DC2（图2a和补充图S2a）。

重症COVID-19患者的髓样细胞组成与轻度病例和对照组的明显不同。CD14+的比例与轻度COVID-19和对照组相比，重度COVID-19中单核细胞显著增加，而CD16+非经典单核细胞（与对照组），CD14 + CD16 +单核细胞（与轻度COVID-19）和DC2相比，重度COVID-19明显降低（相对于轻度COVID-19和对照）（图2b，c）。

CD14 +单核细胞代表主要的外周骨髓细胞类型，并且COVID-19与对照之间CD14 +单核细胞的UMAP表明转录组特征受干扰（图2b）。

在CD14 +单核细胞的差异表达基因（DEG）中，作者发现轻度COVID-19和重度COVID-19病例与对照组相比有116和134个上调基因，而两个COVID-19组之间只有74个上调基因。相比之下，作者发现重度COVID-19与对照组或轻度病例相比分别有217和160个下调基因，而轻度COVID-19与对照相比只有104个下调基因（补充图S2b和表S2）。DEGs上调的基因本体论（GO）术语包括两个COVID-19组对病毒，I型IFN和IFN-γ的反应，以及重度COVID-19中的中性粒细胞激活和能量代谢途径（图2d）。

出乎意料的是，对下调的DEG的GO分析表明，主要在重度的COVID-19病例中单核细胞功能不足，例如I型IFN产生减少，细胞因子分泌，趋化因子产生以及抗原加工和呈递（图2d）。作者进一步检查了与这些GO术语相关的DEG。

许多经典的IFN刺激基因（ISG）包括ISG15，IFITM1，IFITM3，MX1，IRF7，IFI27等在COVID-19患者中的表达水平高于对照组，而与中性粒细胞激活相关的基因（包括S100A8，S100A9，S100A12，CLU和RNASE2等）在重度COVID中的比轻度COVID-19和对照表达水平更高。（图2e）。尽管ISG上调，但作者未能检测到COVID-19中I型或III型IFN的产量高于对照组。

关于下调的基因组，MHC II分子包括HLA-DQA1，HLD-DRA，HLA-DRB1，HLA-DMB，HLA-DMA等，细胞因子/趋化因子基因，包括IL1B，TNF，CCL3，CCL4和CXCL8，在COVID-19患者中表达水平较低，尤其是在那些患有重度疾病的患者中（图2e）。因此，来自COVID-19患者的CD14 +单核细胞中DEG的上调反映了对SARS-CoV-2感染的免疫反应，而来自患有重度COVID-19患者的CD14 +单核细胞中DEG的下调表明了这些细胞的免疫麻痹状态。

髓源抑制细胞（MDSCs）是在炎症条件下扩增的异质未成熟髓样细胞群体，可以抑制T细胞反应21，22。外周血，单核细胞的MDSC具有表型CD14 + HLA-DR - / LO，而单核细胞是HLA-DR阳性23，24。据报道，MHC II分子的下调，钙卫蛋白的增加（S100A8和S100A9）以及免疫抑制功能是MDSCs特征。确实，通过其MHC II分子（较低水平）和钙卫蛋白（较高水平）的独特综合评分与轻度COVID-19和对照中的分数相比，作者确定了重度COVID-19中的单核细胞与MDSCs非常相似（图2f）。在CD14 HLA-DR的水平降低+从重症患者的单核细胞通过流式细胞术（图2g），并且还通过其他研究报告14，18。有趣的是，作者研究中的MDSC样评分与血清CRP，IL-6水平和嗜中性白细胞与淋巴细胞的比例呈正相关，与血液CD3+，CD4+和CD8+T细胞计数的降低呈负相关（图2h） 。

总之，作者的scRNA-seq表征揭示了COVID-19患者外周血髓室的多方面重塑。虽然COVID-19患者的cycling 单核细胞以ISG反应增强为特征，但它们几乎不产生IFN，细胞因子和趋化因子。此外，DC的丢失和MDSC样单核细胞的出现表明它们参与了重症COVID-19患者的免疫麻痹。

备注：免疫麻痹 immunological paralysis 是在一定限度内，抗体的产量随抗原的用量而增加；但抗原量过多，超过一定的限度，抗体的形成反而受到抑制。

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图2：COVID-19患者外周血髓细胞室的单细胞分析。

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3 重度COVID-19中异常激活的肺单核巨噬细胞

作者在重度COVID-19发现支气管肺泡灌洗液单核细胞-巨噬细胞的异常活化8，9。在这里，为了进一步了解肺单核巨噬细胞与其血液对应物之间的联系，并评估它们在COVID-19中的差异作用，作者研究了来自两名轻度和五个重症患者的成对BALF和血液样本。对BALF和cycling 髓细胞的整合分析显示了中性粒细胞（FCGR3B），mDC（CD1C），单核巨噬细胞（CD14，FCGR3A和CD68）的簇（图3a和补充图S3a）。巨噬细胞亚类分类标记，包括FCN1轻度或重度COVID-19患者的外周血和BALF单核巨噬细胞可分别差异表达FCN1，SPP1和FABP4（图3b）。分析来自同一患者的PBMC和BALF单核巨噬细胞的分化轨迹显示，血液向BALF的过程一致（图3c和补充图S3b），与预期的将外周单核细胞募集入炎症组织一致，尽管肺免疫微环境对确切分化轨迹的影响尚待研究和验证。

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图3：重度COVID-19中异常激活的肺单核巨噬细胞

a整合PBMC和BALF样本配对的2位轻度和5位重度COVID-19患者的髓样细胞数据
b单核细胞巨噬细胞标记FCN1，SPP1和FABP4的表达从a投射到UMAP 。
PM，轻度病例的外周细胞；PS，重度病例的外周细胞；轻度病例的BM，BALF；BS，重度的BALF。
c独立分析两名代表性COVID-19患者的血液单核细胞和BALF单核细胞巨噬细胞的分化轨迹。
dVenn图显示了单核细胞-巨噬细胞比较中上调和下调的DEG数量。logFC> 0.41或<–0.41，调整后的P <0.01。
e在单核细胞-巨噬细胞比较中丰富了上调基因（左）和下调基因（右）的GO生物过程（BP）术语，
f热图显示了来自同一患者的配对血液和BALF单核巨噬细胞中所选干扰素，细胞因子和趋化因子基因的表达。星号表示该基因在轻度和重度COVID-19之间在BALF单核巨噬细胞中差异表达。紫色和绿色的星星表明，在重度的COVID-19和轻度的COVID-19组中，基因表达分别显著上调（MAST；P <0.01）。B，BALF样品；P，PBMC样本。
g通过CBA（重度患者的BALF和PBMC之间的双向Wilcoxon检验）测量配对的BALF和血浆样本中所选的细胞因子和趋化因子的水平。

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接下来，作者进行了cycling 和BALF单核巨噬细胞的转录组分析，以了解其功能状态。在DEG中，从轻度和重度COVID-19患者中鉴定出BALF单核巨噬细胞与血液中的524个共享上调基因和501个下调基因（图3d和补充表S3）。如此大量的DEGs提示外周血和肺单核巨噬细胞之间存在显著差异。GO分析显示了BALF单核巨噬细胞中多种免疫途径的广泛激活，包括对IFN和细胞因子的反应，中性粒细胞活化和白细胞迁移，而涉及髓样细胞分化，ATP代谢等的途径则富含血液单核细胞（图3e）。此外，这些比较揭示了与重度COVID-19相关的BALF单核巨噬细胞中受干扰的途径，包括对缺氧，高温，金属离子，创伤和Fc受体信号通路的反应特别上调（图3e），而这些通路与肺泡巨噬细胞的功能被下调，包括脂质代谢，凋亡细胞清除和抗原呈递（图3e）。这些路径中涉及的代表性DEG示于补充图S3c中。

单核细胞巨噬细胞被认为在驱动重度COVID-19 25背后的细胞因子风暴中起关键作用。因此，作者检查了来自同一患者的配对血液和BALF样品中单核巨噬细胞中的细胞因子和趋化因子水平。作者发现所有类型的IFN（IFNA，IFNB，IFNG和IFNL）均在单核巨噬细胞中低表达，而细胞因子（IL1A，IL1B，IL1R2，IL1RN，IL18，IL6，TNF，IL10和TGFB1）和多种趋化因子在来自BALF的单核巨噬细胞中高表达，但在成对的血液样本中却不表达（图3f）。这些数据表明，尽管BALF中的单核细胞巨噬细胞被激活，但它们在外周免疫沉默，这可能是由于病毒刺激或肺部促炎环境的持续参与所致。

与轻度病例相比，重度COVID-19的BALF单核巨噬细胞中抗炎细胞因子（IL1R2，IL1RN和TGFB1）的水平相对较高，而IL18的水平较低，而经典促炎细胞因子（IL1A，IL1B，IL6和TNF）在两组之间相当（图3f）。相反，如作者先前的研究所示，招募单核细胞和中性粒细胞的趋化因子（CCL2，CCL3，CCL4，CCL7，CCL8，CXCL1, CXCL2，CXCL3和CXCL8高表达，而重度COVID-19的BALF中单核细胞巨噬细胞表达的趋化因子（CXCL9和CXCL16）募集的T细胞表达少于轻度病例（图3f）。在蛋白质水平进一步证实了BALFs中细胞因子（IL-1β，IL-6等）和IL-8的水平高于配对血浆，尤其是BALFs中IL-8的水平非常高（图3g）。因此，这些配对分析揭示了重度COVID-19期间组织单核细胞巨噬细胞参与了细胞因子风暴，特别是通过产生趋化因子并募集更多单核细胞和中性粒细胞，但不太可能归因于促炎性细胞因子的过量产生。

4. COVID-19患者外周T细胞簇失调

NK和T淋巴细胞是重要的抗病毒的免疫细胞，其在重度COVID-19耗竭13，26。为了进一步了解失调的NK和T细胞簇，作者重新聚类了这些细胞并鉴定出18个子集（图4a和补充图S4a）。

NK细胞高表达KLRF1，KLRC1和KLRD1, cycling T细胞表达MKI67。

先天性T细胞包括MAIT（SLC4A10），γδT（TRGV9）

NKT细胞（CD3E，KLRF1）

CD4+T细胞包括CD4-Naive（CCR7, SELL），

CD4- LTB，

CD4-GZMK，

CD4-GATA3（Th2）

CD4-CCR6（Th17），

CD4- ICOS（Tfh ），

CD4-GZMB，

Treg- SELL和Treg-CTLA4子集，

而CD8+T细胞包括CD8-Naive（CCR7，SELL），

CD8-LTB，

CD8-GZMK
CD8-GZMB子集。

进行伪时间轨迹分析以推断CD4+和CD8+之间的血统关系T细胞亚群。配对的T细胞受体（TCR）克隆型分析显示，沿推测的轨迹克隆扩增增加（图4b）。

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图4：COVID-19患者外周NK和T细胞簇的单细胞分析

a在PBMC中18个亚群NK和T细胞中的UMAP。

bCD4 +和CD8 + T细胞亚群的拟时序分析。条形图显示了每个T细胞子集中克隆扩增细胞的百分比。

c密度图显示了来自COVID-19患者和对照的外周NK和T细胞的UMAP。

d比较两组COVID-19组和对照组之间每种外周血NK和T细胞类型的百分比（。

e从COVID-19患者和对照克隆扩增的T细胞投影到UMAP

f分别显示COVID-19患者和对照的T细胞亚群的克隆扩增指数

g任何两个簇之间的T细胞状态过渡状态是由它们共享的TCR克隆型推断的。每个T细胞簇都由唯一的颜色表示。条形上方的数字表示在这两个群集中共享TCR的细胞百分比。

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与轻度COVID组和对照组相比，细胞UMAP揭示了在重度COVID-19中T细胞的分布明显受到干扰（图4c）。
在T细胞簇中，重度COVID-19的先天性T细胞（包括MAIT和NKT细胞）的百分比显著低于轻度COVID-19。重度COVID-19患者的CD8-Naive，CD8-GZMK和CD8-GZMB亚群的百分比也低于轻度患者，尽管CD8-GZMB比较的差异无统计学意义（图4d和补充图S4b）。

相反，几种CD4 +重度COVID-19的T细胞亚群，包括CD4Naive，CD4-LTB，CD4-ICOS，Treg-CTLA4以及cycling 性T细胞，显著高于轻度COVID-19。在重度COVID-19中，CD4-GATA3和CD4-CCR6的百分比也呈上升趋势（图4d）。

此外，单细胞TCR（sc-TCR）分析显示，重度COVID-19的几个CD4 +而非CD8 + T细胞亚群的克隆扩增水平高于轻度病例（图4e，f）。一致地，不同T细胞亚群之间的TCR共享分析表明，不同CD4 + T细胞亚群与cycling T细胞之间的活跃交换要多得多，而CD8 +之间却没有重度COVID-19期间的T细胞亚群（图4g）。

作者的数据显示CD4 + T细胞反应的优先激活，但外周血中多个先天样T细胞和CD8 + T细胞亚群的显著耗竭是重度COVID-19的特征性T细胞扰动。为了进一步探索CD8 + T细胞淋巴细胞减少症的线索，作者在患者和对照组之间进行了MAIT，CD8-GZMK和CD8-GZMB亚群的转录组比较（补充图S4c和表S4））。

尽管已鉴定出与病毒感染和IFN应答有关的途径，但没有证据表明COVID-19患者的那些细胞中有T细胞衰竭，细胞死亡途径激活和细胞因子产生的迹象（补充图S4d）。其他小组也注意到了类似的发现， [16]因此，细胞耗竭和死亡不太可能是COVID-19期间T细胞丢失的主要原因。

5. 追踪T细胞功能以及在外周血和BALF中的迁移

作者试图研究COVID-19患者的配对样本中T细胞从血液到BALF的运动轨迹。
首先，作者整合了来自外周血单核细胞（PBMC）和BALF的NK和T细胞数据。将细胞重新分为九种主要类型，包括NK细胞，MAIT，CD4-Naive，CD4-Tm，Treg，CD8-Naive，CD8-Tm，CD8-IL7R和cycling T细胞（图5a和补充图S5a）。PBMC包含大量的naive CD4 +和CD8 + T细胞，而BALF中的naive T细胞则较少，主要由NK细胞，CD4-Tm，CD8-Tm和cycling T 细胞组成（图5b）。

作者进行了基因表达分析，以确定外周血和BALF中NK和T细胞的功能差异（补充表S5）。与外周血对照组相比，作者观察到在BALF的NK，CD4-Tm和CD8-Tm细胞中通常激活了对病毒，I型IFN和IFN-γ的应答（补充图S5b）。作者还注意到更高水平的细胞因子，包括的IFNG，TNF，CSF1，TNFSF10和TNFSF13B ; 趋化因子包括CCL3，CCL4和CCL5 ; IL-15信号模块，包括IL15RA，IL2RB，BALF细胞中的IL2RG，JAK1和STAT3（图5c）。

然而，其它的T细胞相关的细胞因子，包括水平IL4，IL5，IL10，IL13，IL17A，IL17F，IL21，IL25和IL33在血液或BALF中未检测到（补充图中，S5c中）。

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图5：追踪COVID-19患者外周血和BALF中的T细胞

a整合了PBMC和BALF样本配对的2位轻度和5位重症COVID-19患者的T细胞数据，并将其显示在UMAP上。

b比较同一患者的成对的BALF（B）和PBMC（P）中每个T细胞亚群的百分比。

c热图显示来自轻度（M）或重度（S）COVID-19患者的BALF（B）或PBMC（P）中NK，CD4-Tm和CD8-Tm细胞中选定的DEG。细胞因子相关基因标记为红色（logFC> 0.41，调整后的P <0.01）。

d显示了来自7位患者的成对PBMC和BALF中每个T细胞亚群的迁移指数（STARTRAC迁移指数）。

eTCR克隆型分为五种不同类型，分别用不同的颜色标出（单个表示未扩展的TCR克隆型，多重表示扩展的TCR克隆型，双克隆表示在成对的PBMC和BALF样品中共有的那些克隆型）。条形图显示了成对的PBMC和BALF样品中不同T细胞亚群中不同类型TCR克隆型的百分比。

f圈图显示了来自轻度和重度COVID-19组的PBMC和BALF中不同T细胞亚群之间TCR克隆型共享的程度。

g热图显示了每个T细胞克隆中选定的DEG，这些DEGs来自PBMC与BALF区域共有的前13种TCR克隆型（logFC> 0.41，调整后的P <0.01）。

H 列出了前13种双重克隆型的TCRα和β链的V，J基因，并显示了其CDR3的氨基酸序列。

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接下来，作者利用TCR克隆型信息来追踪血液和BALF隔室中正在迁移的T细胞。在血液和BALF样本配对的患者中评估了T细胞克隆扩增状态和克隆型共享（图5d，e）。相当一部分属于CD8-Tm，CD8 CTL和cycling T细胞亚群的BALF T细胞可以将其克隆型追溯到配对的血液对应物中，尤其是在那些患有重度COVID-19的患者中（图5f）。在这里，只有两个轻度病例（M1和M2）具有配对的血液和BALF样本以进行分析，并且显示出在两个隔室中共有的克隆型程度较低（图5f）。重度COVID-19的肺部趋化因子含量较高，可能导致T细胞浸润增加。为了评估迁移的T细胞的功能适应性，作者在血液与衍生自相同T细胞克隆型的BALF T细胞之间进行了转录分析（图5h）。作者发现BALF细胞中ISGs，CCL4，CXCR4，CXCR6，CD69，GNLY等的表达高于血液中的表达，与激活的和组织驻留的表型一致（图5g和补充表S6））。
当前的TCR跟踪分析表明，在COVID-19患者中，外周血CD4+和CD8+T细胞增强了向肺组织的募集，这些细胞被诱导在当地产生细胞因子，并可能导致细胞因子风暴和外周淋巴细胞减少。

资料可用性

本文报道的原始数据已保存在中国科学院北京基因组研究所国家基因组数据中心的基因组序列档案中，登录号为HRA000297，可在http://bigd.big.ac.cn/gsa-human.上公开获得。