一．纳米抗体噬菌体展示文库的构建
1.TG1电转感受态的制备
（1）将TG1细胞划线培养在LB板上，37 °C倒置培养过夜；
（2）挑取单个克隆接种在5 mL 2xTY培养基中，37 °C培养过夜；
（3）接种2 mL过夜培养的菌液至300 mL 2xTY培养基中，37 °C, 220 rpm培养至0D600为1左右；
（4）将菌液放在冰中1 h，1 h后将菌液转移至离心管中， 4 °C， 4000 rpm离心15 min;5)弃上清，加入等体积的1 mM，pH 7.0的Hepes溶液(冰上预冷)重悬菌体， 4 °C，4000 rpm离心15 min；
（6）加入1/2体积的10%甘油重悬菌体，4 °C，4000 rpm离心15 min；
（7）弃上清,每个管中加入10 mL 10%甘油重悬菌体， 4 °C， 4000 rpm离心15 min，弃上清，用枪吸去残留液，加入10%甘油至终体积1 mL。
2.TG1感受态细胞转化效率检测
（1）取2 μL pMECS质粒（10 ng/μL）加入到48 μL制备好的TG1感受态细胞，轻弹混匀，置冰上1 min。
（2）转入电击杯中（-20 °C预冷），电压设置为1700 V，进行电转，电转完立即用800 μL 37°C预热的SOC培养基混匀吸出，转至试管中；
3) 37 °C, 220 rpm摇床培养1 h,取出菌液,梯度稀释,最终取100 μL涂在LA+GLU板上，37 C培养过夜，计算转化效率;
3.噬菌体纳米抗体文库的形成
（1）感受态转化效率检测完成后，将100 μL的连接产物加至1 mL的电转TG1感受态中，混匀；
（2）在每个电击杯中(-20 °C预冷)分装40 μL感受态，将电击杯置入电转仪，1700V电击，使重组噬菌粒进入感受态细胞；
（3）电击结束后加入SOC培养基1 mL，吹打电击杯，转入37 °C预热的锥形瓶中，最后再用2 mL SOC培养基将所有电击杯洗刷一-次，转入锥形瓶，37 °C摇床培养1 h；
（4）1h后，将菌液收集到50mL离心管，25°C，4000rpm离心10min，用5mLSOC重悬菌体，取出50 μL用以梯度稀释，以便测定库容。其余菌液平均涂在10个LA+GLU板.上，37°C，培养16 h；
（5）将培养好的板取出，每个板加入5 mL液体LB培养基，用涂布棒将菌体刮下，倒入锥形瓶，再用3 mL LB冲洗-遍板，并入锥形瓶；
（6）将菌液转入50 mL离心管，25 °C，4000 rpm离心10 min,弃上清。加入30 mL15%甘油+LB液体培养基，漩涡振荡重悬，分装于1.5 mL EP管，-80 °C保存备用。
二．噬菌体构建技巧
噬菌体文库的库容量和多样性是衡量文库质量的重要标准之一，容量越大、多样性越好的库是成功筛选出纳米抗体的有效保证；
影响文库容量和多样性的关键点包括：提取RNA过程中RNA的降解、反转录过程中的模板和引物、扩增过程中引物的选择和模板的用量以及PCR扩增轮数、感受态细菌的转化效率、连接体系的大小等因素。
泰克生物可为客户提供来自驼源VHH纳米抗体库，以及其他物种scFv形式抗体的酵母展示文库构建及筛选服务。VHH纳米抗体库，又称为驼源重链抗体文库，抗体分子量大小为15kDa，是驼源动物产生的特有的一种抗体。酵母抗体文库展示体系受限于自身物理特性限制，物理库容滴度一般<10^7，因此主要应用于客户对项目库容要求不高，动物免疫后PBMC细胞经过二次分选以及避免漏掉二硫键形成的抗体发现项目。同时酵母展示文库相对噬菌体展示文库技术而言，前者在微量抗体表达后抗体活性层面相较于后者要高，得益此基础，在流式筛选时就能区分抗体的亲和力高低。
