表面等离子共振（SPR）——分子互作检测“金标准”

表面等离子共振(SPR)技术是一种基于光学的生物分子相互作用体外仪器检测方法。通过检测生物传感芯片上配位体与分析物之间的相互作用情况，进而探测物质的性质和结构。常见的的体外仪器互作技术还有MST、BLI、ITC，SPR技术作为分子互作领域的“金标准”相对来说更为常用，若大家想要了解他们四者的区别，可以去阅读小源往期的内容——体外仪器互作技术——SPR、BLI、MST、ITC，助力快速筛选互作分子，本期小源主要带大家一起了解SPR。

相较于传统分子互作检测技术（如酵母单双杂一对一、Pull-down、Co-IP、EMSA、LCA等）的耗时费力、信息量少、灵敏度低的特点，SPR检测技术具有灵敏度高、无需标记、实时监测等优势。目前SPR技术已成为药物发现和基础研究的重要工具，广泛应用于生物医学领域。其核心应用主要聚焦于两个方向：分子互作分析研究与分子垂钓。

• 分子互作分析研究

• 分子互作研究包括蛋白-小分子相互作用、蛋白-蛋白相互作用、蛋白-核酸相互作用、核酸-核酸相互作用、抗体-抗原相互作用等。通过SPR技术，可以实时、动态地监测生物分子间的结合过程，获取结合动力学参数（如结合速率常数，解离速率常数，平衡解离常数等），从而深入理解分子间的相互作用机制，为药物靶点验证、抗体表征等研究提供依据。

表 几种传统检测分子互作技术与SPR对比

01 案例一 蛋白-小分子相互作用

中科院北京基因组研究所江华亮团队在Cancer Cell上发表的名为“Small-Molecule Targeting of E3 Ligase Adaptor SPOP in Kidney Cancer”的论文中，研究者针对透明细胞肾细胞癌（ccRCC）中SPOP蛋白的异常（在细胞质中过表达而非细胞核）会促进肿瘤生长的问题，成功设计并优化出一种小分子抑制剂6b。且利用SPR等实验明确了该抑制剂的核心机制：通过抑制SPOP与底物蛋白的相互作用，来阻断致癌信号通路。

图 SPOP抑制剂与SPOP结合

02  案例二 蛋白-蛋白相互作用

美国德克萨斯州大学何平团队在Nature上发表的名为“Phytocytokine signalling reopens stomata in plant immunity and water loss”的论文中，研究者利用SPR技术验证了SCREWs与受体激酶NUT的结合能力，检测结果表明SCREWs与NUT的亲和力达到了uM级别，表明两者的结合强度较好，由此确定了NUT是SCREWs的受体。

图 SPR检测不同类型的SCREWs

与NUT胞外域的亲和力

03  案例三 蛋白-核酸相互作用

在Plant Physiology上发表的名为“RBP differentiation contributes to selective transmissibilityof OPT3 mRNAs”的论文探讨了OPT3在木本（苹果）与草本（拟南芥）中传递性的差异，研究利用SPR分析各属间RBPs与OPT3的亲和力，结果发现苹果的RBPs与苹果MdOPT3的亲和力显著高于拟南芥，阐明了OPT3 mRNA长距离传递能力种间差异的分子机制。

图 候选RBP与MdOPT3、MxOPT3

和AtOPT3 3′-UTR结合的SPR分析

• 分子垂钓

分子垂钓则是以固定化的已知蛋白为“诱饵”，从复杂样本中（例如化合物文库、细胞裂解液）直接筛选并鉴定相互作用分子，主要用于筛选研究中。

表 SPR与酵母建筛对比

在Journal of Pharmaceutical Analysis期刊上发表的一篇名为“A strategy of screening and binding analysis of bioactive components from traditional Chinese medicine based on surface plasmon resonance biosensor”的论文，研究基于SPR的分子垂钓从白芍中筛选到与肿瘤坏死因子受体1型（TNF-R1）结合的芍药素和芍药醇两种活性成分，后续研究者进行了SPR的竞争测定和分子对接，结果表明这两种化合物在与TNF-R1的子结构域1位点结合的同时，可以与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）竞争。

图 从白芍（RPA）中筛选和鉴定与TNF-R1结合成分

在了解SPR具体应用后，小源接下来将从技术原理、技术流程、技术结果参数认识等方面介绍SPR，希望对大家更好地了解这项技术及看懂实验结果有一定帮助。

• 技术原理

基于光在金属（通常是金）薄膜表面激发表面等离子体波的物理现象。当生物分子在金属传感器芯片表面结合时，会引起附近折射率的微小变化，从而导致共振角发生偏移。通过实时监测这个共振角的变化，就能实时、无标记地检测分子结合和解离的过程。

• SPR类型

SPR类型有两种，分别是SPR单浓度检测和SPR多浓度检测，两者可达到不同的实验目的，单浓度适合快速筛选，而多浓度则用于深入分析分子相互作用的细节，有助于计算结合常数（Ka）和解离常数（Kd），从而更好地理解分子间的相互作用。

01  SPR单浓度检测

通常指在一次结合-解离循环中，依次注入单一浓度的多个不同分析物，即使用单一浓度的物质进行筛选，快速对大量候选互作的物质进行亲和力排序，多用于初步筛选研究中。例如需要在多种小分子化合物中去筛选哪些化合物能够和受体A结合，那在这种情况下可用单浓度SPR检测。

SPR单浓度检测不能精确测定结合强度，无法得到准确的动力学参数（Ka、Kd）。

图 51个小分子化合物对蛋白A

的亲和力初筛（单浓度SPR）

02  SPR多浓度测定

指对同一种分析物，设置一系列梯度浓度（如0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20nM），依次进样并完整记录每个浓度的结合和解离曲线。其可以做到精确分析，获取可靠的结合常数（Ka）、解离常数（Kd）和亲和力常数（KD），全面揭示相互作用的动力学机制。例如通过上述单浓度SPR技术（或者其他筛选实验）筛选出与蛋白A亲和性较好的化合物B，可通过多浓度SPR检测获得两者互作的动力学和亲和力参数，深入分析其互作机制。

图 两种分子间的相互作用分析（多浓度SPR）

• 技术流程

1、配基偶联：将两个物质中的一个作为配体偶联在芯片上；

2、样品进样：另一个物质作为分析物从芯片上流过；如果两个物质有相互作用，仪器会进行记录；

3、芯片再生：使用再生缓冲液去除全部的分析物；

4、数据分析：使用仪器自带的软件进行数据分析；

图 SPR流程示意图

• 动力学互作参数解读

结合常数Ka:代表复合物（AB）的形成速率，在1M的A和B下，每秒产生的复合物数量。单位为M-1S-1,一般从103到107M-1S-1。

解离常数Kd:反应了复合物的稳定性，每秒钟解离的复合物的百分比。

Kd=0.01S-1，即为每秒钟有1%的复合物解离，Kd越大，解离越快。单位为S-1，一般在10-2至10-5S-1。

亲和力常数KD:反应了相互作用结合能力的大小，越小亲和力越高（下表所示），Kd/Ka的比值，是平衡常数的倒数。单位为M，检测范围为mM~pM。

表 亲和力常数KD值与结合强度关系

图 SPR结果示意图

• SPR检测可提供信息

（1）是否结合；

（2）结合的特异性与选择性；

（3）两种分子的结合强度（亲和力）；

（4）结合和解离的快慢和复合体的稳定性（动力学）；

（5）分子结合的温度与热力学特征；

（6）目标分子活性含量的检测；

（7）能跟踪监控固定的配体的稳定性。

• 技术优劣势

SPR优势：

1、无标记检测：无需对样品进行标记，避免了标签、生物素或者同位素的干扰；

2、实时检测：可以实时观察到分子间结合和解离的过程；

3、高分辨率，高灵敏度：能够检测出非常弱的相互作用；

4、信息量多：不仅可以检测有没有相互作用，还可以检测相互作用的亲和力，动力学和浓度等信息

SPR劣势：

1.对于样品组成以及温度等干扰因素比较敏感。

2.对于非特异性吸附比较难区分。

• 常见问题

Q1：SPR的样品需要满足什么要求？

答:①均一性：确保样品充分水溶，样品中没有任何沉淀、颗粒——保持样品处于均一的、不聚集的状态；

②蛋白纯度（>80%），蛋白浓度>1mg/ml，浓度越高越好；明确等电点/分子量信息；

③分析物样品中不能含有甘油、蔗糖、咪唑等高折光的成分；氨基偶联的配体溶液中不能含有tris、NaN3、甘氨酸等成分；小分子需要知道有机溶剂信息。

Q2:  互作结果分析中应该选择哪种拟合模式？

答:关于拟合模式的选择，是选择动力学（Kinetics）分析还是亲和力（Affinity）分析，主要是根据响应值图谱的形状来判断的。对于动力学分析，要求响应值图谱在结合和解离阶段均展现出足够的曲率（“慢结合慢解离”，图1），而亲和力分析则要求在每次的分析物进样阶段均达到稳态（图2）。对于同时满足两种要求的响应值图谱，理论上两种分析模式均可以使用（图3）。

图1  

  图2 

  图3

Q3:  SPR做kinetics 1:1 binding拟合kd超限导致拟合有误差，affinity拟合不可信，这样的数据如何拟合和分析?

答：可以从以下方面优化：

①优化实验条件，降低分析物浓度至几十RU，提高流速，延长解离时间，以提高信号捕捉的准确性；

②优化数据处理与分析，选择合适的模型（如双位点模型或考虑质量传递影响的模型），对整个数据集进行全局拟合，并仔细校正基线和扣除背景信号，减少误差。

Q4:  SPR测定结合过程中基线一直上升如何解决？

答：若发现基线一直在上升，可能是由于缓冲液或样品中存在非特异性吸附导致的。可以尝试在缓冲液中添加适量的BSA（如1%），或加入适量的表面活性剂（如吐温20），增加洗涤步骤以减少非特异性吸附；或者调整流速，适当提高流速，有助于减少蛋白在芯片表面的非特异性吸附。

Q5:  共价非可逆化合物是否可以用该方法测亲和力？

答：是可以使用的，例如，使用单循环方法，通过在多个不同浓度下进行单次注射，观察结合曲线的饱和情况，从而间接推断亲和力。值得关注的是共价非可逆化合物的亲和力测量结果可能受到实验条件（如浓度、温度、缓冲液组成等）的显著影响，因此在设计实验和结果时解读需加以注意。

• 小源小结

SPR技术凭借无标记、实时、高灵敏的特性，已成为分子互作研究不可或缺的工具。无论是验证已知相互作用，还是从复杂体系中“垂钓”新靶点，SPR都能提供丰富且可靠的动力学与亲和力数据，助力科研与药物研发走向更精准、更高效的新阶段。