进行基因差异分析
1.读取数据
rm(list = ls()) ## 魔幻操作，一键清空~
options(stringsAsFactors = F)#在调用as.data.frame的时，将stringsAsFactors设置为FALSE可以避免character（字符）类型自动转化为factor（因子，如0，1）类型
# 注意查看下载文件的大小，检查数据
load(file = 'step1-output.Rdata')#加载第一步保存的文件，此文件包括dat和group_list，加载后得到此两数据
dat
group_list
2.检测数据
# 每次都要检测数据
dat[1:4,1:4] #查看1到4行和1到4列的dat文件
table(group_list) #table函数，查看group_list中的分组个数
dat[1:4,1:4]
table(group_list)
3.为每个数据集绘制箱形图，比较数据集中的数据分布（单一某个基因分析）
boxplot(dat[1,]~group_list) #按照group_list分组画箱线图,定义分组，（此步骤可以省略）
bp=function(g){ #定义一个函数g，函数为{}里的内容
library(ggpubr)
df=data.frame(gene=g,stage=group_list)#把分组和数据糅合在一起
p <- ggboxplot(df, x = "stage", y = "gene",#定义图形的横纵坐标
color = "stage", palette = "jco",
add = "jitter")#
p + stat_compare_means()# Add p-value值
}
bp(dat[1,]) ## 调用上面定义好的函数，避免同样的绘图代码重复多次敲。
bp(dat[2,])
bp(dat[3,])
bp(dat[4,])
dim(dat)
4.对某种基因在样本中的表达情况根据分组统一分析（所有基因一起分析）
4.1数据表达形式
用limma包，这里注意，limma包是对基因芯片表达矩阵的分析，不能对逆转录RNAseq表达矩阵进行分析（因为数据特征不同），RNAseq需要用另一种方法
library(limma)
design=model.matrix(~factor( group_list ))#把分组信息变化成因子
design
fit=lmFit(dat,design)#在给定一系列阵列的情况下，拟合每个基因的线性模型
QQ截图20190326210520.jpg
fit=eBayes(fit)#eBayes函数指在微阵列线性模型拟合下，通过经验Bayes对标准误差向一个共同值的缓和，计算缓和t-统计、缓和f-统计和微分表达式的对数概率。 用法举列：EBAYES（配合，比例=0.01，标准偏差，系数，极限值=C（0.1,4）
## 上面是limma包用法的一种方式
#把上面计算出的差异再进行处理
options(digits = 4) #设置全局的数字有效位数为4
#topTable(fit,coef=2,adjust='BH')
topTable(fit,coef=2,adjust='BH') #提取一个表的列上的基因从一个线性模型的拟合
#例子：topTable(fit, coef=NULL, number=10, genelist=fit$genes, adjust.method="BH",
#sort.by="B", resort.by=NULL, p.value=1, lfc=0, confint=FALSE)
所有基因差异总数据表
解读此表
表中数据意义
但是上面的用法做不到随心所欲的指定任意两组进行比较，所有还有下一种方法
design <- model.matrix(~0+factor(group_list))#把分组变成因子形式
以分组信息为因子得到design
colnames(design)=levels(factor(group_list))#改design列名为分组信息
改之后列名变了
head(design)#查看分组文件
exprSet=dat#exprSet 为表达矩阵
rownames(design)=colnames(exprSet)#更改分组信息design行名为分组名，也就是样本名字
design
#构造了design矩阵，得出每一个样本属于哪一个组，属于为1，不属于为0
QQ截图20190326213059.jpg
处理好了分组信息，再自定义比较元素
#自定义比较元素
contrast.matrix<-makeContrasts("noTNBC-TNBC",
levels = design)
#也可以用下面的，和上面等同意思
#contrast.matrix<-makeContrasts("paste0(unique(group_list),collapse = "-")，levels = design)
contrast.matrix ##这个矩阵声明，我们要把 Tumor 组跟 Normal 进行差异分析比较
自定义函数进行比较
deg = function(exprSet,design,contrast.matrix){#定义一个叫deg的函数
##step1#logFC后是前的多少倍,进行差异化比较
fit <- lmFit(exprSet,design)
##step2
fit2 <- contrasts.fit(fit, contrast.matrix)
##这一步很重要，大家可以自行看看效果
fit2 <- eBayes(fit2) ## default no trend !!!
##eBayes() with trend=TRUE
##step3
tempOutput = topTable(fit2, coef=1, n=Inf)
nrDEG = na.omit(tempOutput)
#write.csv(nrDEG2,"limma_notrend.results.csv",quote = F)
head(nrDEG)
return(nrDEG)
}
deg = deg(exprSet,design,contrast.matrix)
head(deg)#查看前几行文件
save(deg,file = 'deg.Rdata')#存储文件
#得出了两两差异化比较的图
得出所有基因差异化数据表
4.2分析基因表达差异的可视化表示：火山图，热图
for volcano 火山图
if(T){
nrDEG=deg
head(nrDEG)
attach(nrDEG)
plot(logFC,-log10(P.Value))
library(ggpubr)
df=nrDEG
df$v= -log10(P.Value) #df新增加一列'v',值为-log10(P.Value)
ggscatter(df, x = "logFC", y = "v",size=0.5)
df$g=ifelse(df$P.Value>0.01,'stable
', #if 判断：如果这一基因的P.Value>0.01，则为stable基因
ifelse( df$logFC >2,'up', #接上句else 否则：接下来开始判断那些P.Value<0.01的基因，再if 判断：如果logFC >1.5,则为up（上调）基因
ifelse( df$logFC < -2,'down','stable') )#接上句else 否则：接下来开始判断那些logFC <1.5 的基因，再if 判断：如果logFC <1.5，则为down（下调）基因，否则为stable基因
)
table(df$g)
df$name=rownames(df)
head(df)
ggscatter(df, x = "logFC", y = "v",size=0.5,color = 'g')
ggscatter(df, x = "logFC", y = "v", color = "g",size = 0.5,
label = "name", repel = T,
#label.select = rownames(df)[df$g != 'stable'] ,
label.select = c('TTC9', 'AQP3', 'CXCL11','PTGS2'), #挑选一些基因在图中显示出来
palette = c("#00AFBB", "#E7B800", "#FC4E07") )
ggsave('volcano.png')
ggscatter(df, x = "AveExpr", y = "logFC",size = 0.2)
df$p_c = ifelse(df$P.Value<0.001,'p<0.001',
ifelse(df$P.Value<0.01,'0.001<p<0.01','p>0.01'))
table(df$p_c )
ggscatter(df,x = "AveExpr", y = "logFC", color = "p_c",size=0.2,
palette = c("green", "red", "black") )
ggsave('MA.png')
}
for heatmap
if(T){
load(file = 'step1-output.Rdata')
# 每次都要检测数据
dat[1:4,1:4]
table(group_list)
x=deg$logFC #deg取logFC这列并将其重新赋值给x
names(x)=rownames(deg) #deg取probe_id这列，并将其作为名字给x
cg=c(names(head(sort(x),100)),#对x进行从小到大排列，取前100及后100，并取其对应的探针名，作为向量赋值给cg
names(tail(sort(x),100)))
library(pheatmap)
pheatmap(dat[cg,],show_colnames =F,show_rownames = F) #对dat按照cg取行，所得到的矩阵来画热图
n=t(scale(t(dat[cg,])))#通过“scale”对log-ratio数值进行归一化，现在的dat是行名为探针，列名为样本名，由于scale这个函数应用在不同组数据间存在差异时，需要行名为样本，因此需要用t(dat[cg,])来转换，最后再转换回来
n[n>2]=2
n[n< -2]= -2
n[1:4,1:4]
pheatmap(n,show_colnames =F,show_rownames = F)
ac=data.frame(g=group_list)
rownames(ac)=colnames(n) #将ac的行名也就分组信息（是‘no TNBC’还是‘TNBC’）给到n的列名，即热图中位于上方的分组信息
pheatmap(n,show_colnames =F,
show_rownames = F,
cluster_cols = F,
annotation_col=ac,filename = 'heatmap_top200_DEG.png') #列名注释信息为ac即分组信息
}
write.csv(deg,file = 'deg.csv')
dev.new()
热土和火山图都是傻瓜式的，只要的前面得出的deg数据(也就是基因差异表达数据）是正确的
