1.复苏时遇到冻存时挖的坑

实验室偶尔也会发生这样的情况：

“靠，细胞要死了，赶紧冻掉，不能让细胞死在我手里。”

“天呢，细胞培养液都这么黄了，赶紧冻掉。”

“妈呀，细胞融合度都逼近100%了，赶紧冻掉。”

“咦，细胞好像少了点，算了，就这样吧。”

如果你复苏的细胞就是上面这些人所留下来的，那就要格外注意了。

>>解决方法：

所谓知己知彼才能百战不殆，在复苏前，一定要先清楚地了解这份细胞的增殖能力。如果增殖能力不高，接种时就要增加细胞接种密度并添加5%~10%的血清。如果细胞本身数量就非常少，也可以不离心，直接接种培养（加入培养基的体积＞5倍的冻存细胞体积）。复苏后3天内尽量少对细胞进行操作，延迟换液时间。

2.无孔不入的微生物

做实验就像走钢丝，稍不留神就会跌进充满微生物的沼泽中不能自拔。

>> 解决办法：

冻存时，一定要拧紧冻存管的盖子，否则水浴复苏的时候，水浴锅中的水就会渗入到冻存管中去，造成细胞的污染并会使那些低免疫力的接受移植的患者产生严重的感染。

3.细胞非正常“复苏”

那是一个安静的下午，大家都在专心地做着实验，突然听到有人大叫“这是谁的细胞，一直放在外面，都化了。”原来刚才同事取细胞的时候，把整个冻存架都拿了出来，后来居然忘记再把它放回液氮罐中。而此时细胞们已经无一幸免地 “融化了”。

适用于冻存袋

适用于冻存管

>>解决办法：

马上种瓶，千万不要把这些细胞继续放回液氮罐中冻存。此时细胞内已经有大量的冰晶形成，细胞膜已经受到损伤，如果离心就会造成细胞膜完全破碎、细胞立即死亡的后果。所以切记不要离心，而应直接种瓶，也不要进行吹打，只轻轻摇晃。培养时加入10%的血清，种瓶后48h内都不要对细胞进行操作。这是一个真实的案例，后来在大家的努力下，那些增殖能力本来就旺盛的细胞还是活了下来。

备注：本办法也同样适用于那些停电后造成超低温冰箱升温（一般升温到-40℃时就要小心了）的情况。

4.拿错了细胞，养了别人家的“孩子”

电视剧里抱错孩子的狗血剧情也同样会发生在实验室中。学校的液氮罐基本上都是公用的，所以如果样本标记不详就会发生拿错的情况。

>>解决办法：

每支冻存管上都应用冻存专用的记号笔详细标记上细胞名称、冻存时间、样本批号等信息并将这些信息详细记录在册。存放细胞时，最好规定每个人的存放位置，免得下次找细胞的时候非要把整个液氮罐翻个底朝天才找得到。复苏拿取细胞时，也应在对应的存放位置处进行查找，找到对应的细胞后应核查记录册上的信息是否与冻存管上的细胞名称、冻存时间、样本批号一致。

5.如何让冻存的组织满血复活?

很多时候我们都会遇到组织复苏培养的成功率低、长势慢的情况，这到底是哪里出错了呢？

>>解决办法：

（1）组织要剪得足够小；

（2）程序降温盒不要立马放入-80℃冰箱中，应先置于4℃冰箱内15min~30min；

（3）冻存液的体积应至少是组织体积的2~3倍；

（4）组织复苏后进行培养时，应在培养基中加入5%～10%的血清。

6.复苏后，细胞不见起色就扔掉？！

复苏2~3天后，认为细胞没有明显增殖就扔掉细胞，但其实有些细胞需要复苏一周后才会发生明显的变化。

>>解决办法：

如果复苏培养3天后细胞仍不见增殖，先不要着急换液。试着补加血清、细胞因子，等一周后再看细胞增殖情况再定。

细胞复苏

细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

实验前准备： a. 将水浴锅预热至37℃ b. 用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。 c. 在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

1. 根据细胞冻存记录取出需要复苏的细胞。

2. 迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

3. 约1-2 min后冻存管内液体完全溶解，取出放入离心机中以1000 rpm/min速度离心3~5 min。

4. 用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。吸弃上清液，向离心管内加入1 ml培养液，吹打制成细胞悬液。

5. 将细胞悬液分装入培养瓶或者培养皿内，将培养瓶/培养皿放入37℃，5％ CO2的培养箱内过夜后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。

细胞冻存

冻存前准备：

a. 准备适量冻存管，做好标记后置于4℃冰箱预冷；

b. 配制冻存液，一般为用培养液配制10% DMSO；

c. 梯度冻存盒。

1. 按照细胞传代步骤1-7操作制备细胞悬液并离心；

2. 弃去上清，加入适当体积的冻存液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液；

3. 将1 ml细胞悬液加入加入之前已做好标记的冻存管中并做好记录；

4. 将冻存管放入梯度冻存盒然后保存至-80℃过夜（如果没有冻存盒，可以先在4℃冰箱放置30 min，然后转移至-20℃放置1-2 h，最后转移至-80℃过夜），第二天取出放入液氮罐，并记录好位置信息。

注意事项

1.刚刚复苏的细胞就像刚刚出生的小BABY一样脆弱。一切接触细胞的动作都要尽可能地轻柔。

2.低速离心，离心力不超过300g。

3.除了极少数细胞对DMSO过敏外，大部分的细胞都不需要去除DMSO。细胞复苏后可直接接种，第二天进行换液即可。

4.配置好的冻存液在4℃冰箱内可以暂存1周，在-20℃冰箱内可以保存一个月。不过最好还是现配现用、不要反复冻融。

5.DMSO存在一定的毒性，配置冻存液时一定要戴好手套。

6.复苏时使用的培养基最好与冻存前使用的培养基一致。

7.取冻存盒的时候一定要谨防冻伤，不要把你的小鲜肉“粘”到冻存盒上面。

8.复苏第二天看一下细胞，如果细胞状态不行可以补加一下血清、因子。