内皮细胞是血管生物学研究中最受关注的细胞类型之一。原代内皮细胞直接来源于活体组织，具有正常二倍体核型，未经永生化处理，能够较真实地反映体内血管内皮的生理和病理状态。与永生化细胞系相比，原代细胞在基因表达谱、功能反应等方面更接近体内真实情况，因此在基础研究和药物研发中具有不可替代的价值。
内皮细胞的应用价值
内皮细胞是构成血管内壁的单层扁平上皮细胞，形态呈多边形，细胞的边缘呈锯齿状并相互嵌合，覆盖于动脉、静脉和毛细血管的内表面，形成血液与周围组织之间的机械屏障。在应用层面，原代内皮细胞已被广泛用于：
血管生物学研究：研究血管生成、血管通透性、炎症反应等核心生理病理过程；
药物筛选与毒理学评估：可利用原代细胞建立的高通量筛选模型快速高效地寻找能调节内皮细胞功能的先导化合物，以及评估心血管药物、抗肿瘤药物等对血管系统影响；
组织工程与再生医学：可构建血管类器官、类器官芯片，通过引入内皮细胞构建微血管网络，为类器官提供营养，解决因缺氧、代谢物堆积而坏死的问题；
肿瘤学研究：通过建立内皮细胞-肿瘤细胞共培养模型，可以模拟肿瘤诱导血管生成的微环境，用于筛选抗血管生成的靶向药物。
然而，原代内皮细胞的分离培养一直是块“硬骨头”。本文将系统梳理从小鼠心脏中分离培养微血管内皮细胞的全流程，助你突破实验瓶颈。
内皮细胞的提取、分离与培养
（以小鼠心脏微血管内皮细胞为例）
1.心脏组织获取
将小鼠安乐死后，全身于75%酒精溶液中浸泡3-5min，无菌环境下逐层打开胸腔，小心迅速取出小鼠心脏，并立即置于预冷的无菌PBS中清洗干净，将清洗干净的小鼠心脏小心去除左右心房、瓣膜组织和结缔组织，将余下的心脏组织用70%酒精浸泡15s，以灭活心肌内外膜细胞。
2.组织块制备
PBS清洗干净后加入少量HyCyte®通用型内皮细胞完全培养基ECM并尽量剪碎心肌组织。
3.酶消化
将剪碎后的组织块转移至离心管中，加入Ⅱ型胶原酶，在37℃下孵育1h；随后补加DNase I溶液，再次在37℃消化30min，加入完全培养基终止消化，将消化后的组织块通过细胞筛去除未消化的组织块，收集滤液。
4.分离纯化
将滤液在300g下离心5min，弃上清，沉淀用HyCyte®通用型内皮细胞完全培养基ECM重悬。将细胞悬液接种至培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱孵育1.5-2h，此时成纤维细胞优先贴壁，内皮细胞仍悬浮。收集上清液，接种至预先用明胶包被的培养瓶中，于培养箱中培养。
5.传代培养
24 h后首次换液，去除未贴壁细胞，后续每2-3天换液一次，细胞汇合至80%-90%时可传代，按照1：2的传代比例接种细胞，可传2-3代。
6.鉴定
海星生物（HySigen）通过CD31或血管假性血友病因子（vWF）免疫荧光染色鉴定，结果应呈阳性；细胞纯度达90%以上；微生物检测应显示不含细菌、真菌等污染。
小鼠心脏微血管内皮细胞纯度检测
注意事项
1.成纤维细胞污染
内皮细胞呈多角形或短梭形，汇合后紧密排列呈“鹅卵石”或“铺路石”样；成纤维细胞呈细长梭形，排列成漩涡状或放射状，方向一致。在取材阶段务必剔除干净左右心房、血管根部及心外膜的脂肪结缔组织，若发现成纤维细胞区域性生长旺盛，可尝试用枪头刮除避免损伤血管中膜。
2.细胞贴壁率低
从处死到心脏离体，放入PBS中全程尽量控制在1-2min，缺血时间过长会导致内皮细胞发生不可逆的缺氧性损伤，贴壁率大幅降低。
海星生物HyCyte®原代内皮细胞
海星生物依托先进的技术平台，推出了多物种多组织来源的HyCyte®原代内皮细胞产品。每一株细胞均结合内皮细胞专用培养基筛选制备而来。经过免疫荧光和细胞纯度鉴定，同时确保无支原体、细菌、真菌等污染，品质经得起最严格的实验验证。
技术服务：CRISPR/Cas9细胞基因编辑、CRISPR文库筛选/文库病毒/载体构建、分子诊断参考品/突变基因参考品/融合基因参考品、细胞稳转 / 细胞干扰
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