summary:
sestrins保护细胞免受氧化应激损伤，但是具体机制还不明确。Nrf2-keap1通过调控抗氧化酶调节氧化应激。Sesn1 和Sesn2 与Nrf2 的抑制剂 Keap1, 自噬底物p62, 和泛素连接酶Rbx1相互作用。 这种抗氧化功能受P62相关的keap1自噬降解并激活Nrf2激活的调节。在大鼠肝脏中，经过禁食和高碳水化合物再喂食后，sesn2表达上调。（因为再喂食后激活P62，促进keap1的降解和Nrf2的激活。）sesn2敲除抑制keap1的降解和Nrf2的激活，而且再喂养后脂质的急性刺激增加了肝脏对氧化应激的敏感性。
INTRODUCTION：
p53的两个靶基因Sestrin1 (Sesn1) 和Sesn2, 具有抗ROS的作用。其抗氧化作用可能与它们的亚磺酸还原酶活性有关。这种活性对于维持过氧化物酶(Prxs)处于活性状态是必要的。Prxs是过氧化物酶的一个家族，其中半胱氨酸是过氧化物还原过程中氧化的主要位点。半胱氨酸过度氧化为亚磺酸使得Prxs失活。高氧灭活的Prx通过硫氧多辛(Srx)催化的反应被重新激活。有人提出，Sesns还可以催化这种半胱氨酸-亚磺酸还原反应，从而通过维持Prx活性，抑制ROS积累。然而，sesn和Srx在氨基酸序列上没有相似之处。Sesns不具有还原酶功能。
尽管其潜在机制尚不清楚，但很明显，sesn能保护细胞免受氧化应激。在研究Sesn2对小鼠肝脏的保护作用时，在禁食在喂养过程中，Sesn2对Srx激活是至关重要的。Srx基因是转录因子Nrf2(核因子红系2相关因子2)的靶基因。Nrf2可调节许多抗氧化基因功能，keap1作为其抑制剂，可调节其作用。我们寻找Sesn2和Nrf2通路之间的联系，发现Sesn2促进Keap1的自噬降解，从而上调Nrf2信号，促进Srx等抗氧化酶基因的表达。因此，我们确定了Sesn2通过激活Nrf2信号通路发挥抗氧化功能。并保护小鼠肝脏免受急性脂肪生成刺激引起的氧化损伤。
RESULTS
1.Sesn2诱导Keap1降解和Nrf2活化
为研究Sesn2是否调节Nrf2-Keap1相关信号通路, 我们用慢病毒转染表达FLAG epitope-tagged Sesn2 (F-Sesn2) 和HA-taggedKeap1 (H-Keap1)的细胞。
图1A 显示在HEK293 细胞 HCT116 和 HeLa 细胞过表达sesn2后，keap1的蛋白水平降低，但mRNA（图1B）未受到影响。（sesn1作用相同，见附件）
Sesns具有保守，氧化应激敏感性半胱氨酸残基，如sesn2的C125。但是sesn2突变体C125半胱氨酸残基替换成丝氨酸后，keap1丰度依然降低了。
Keap1是Nrf2激活的抑制因子。
我们检测了共表达F-Sesn2或F -Srx的HEK293细胞中，亚磺酸还原酶活性和Keap1丰度下调情况。过表达F-Srx可以下调H2O2诱导的Prx,但对H2O2诱导的keap1丰度无影响。相反，过表达F-Sesn2，keap1含量降低，Prx无影响。这些结果标明sesn2不是亚磺酸还原酶，sesn2与Srx不分担生物学功能。
2.sesn2诱导的Keap1降解是由p62依赖的自噬介导，并由Rbx1促进
调节sesn2-keap1通路蛋白有很多，其一是P62，作为自噬底物与Nrf2竞争性结合keap1。
我们首先研究了Sesn2相关的Keap1丰度的下调是否与Keap1的降解有关？
（用自噬抑制剂证明由自噬介导）在共表达 sesn2和Keap1的HEK293中，加入蛋白酶体抑制剂MG132或自噬抑制剂氯喹或3-甲基-苯胺。免疫印迹分析表明，MG132轻微增加了sesn2介导的Keap1丰度下降。而氯喹或3-甲基-苯胺减弱这种作用。表明 sesn2导致的keap1降解是由自噬介导的。
为了确定Sesn2是否刺激自噬，我们用共转染F-Sesn2和H-Keap1的HEK293细胞，检测LC3的脂化，这是自噬的一个特征，可以将LC3- i亚型转化为电泳上更具流动性的LC3- ii亚型。我们发现，过表达sesn2可以增加LC3-II的含量。F-Sesn2使GFP-LC3的分布从弥漫性改变为胞质点状。后者代表脂化LC3对自噬体膜的修饰。
利用自噬缺陷进一步研究了自噬的作用。ATG7-deficient (Atg7-/-), or p62-deficient (p62-/-)自噬缺陷的MEFs细胞共转染F-Sesn2 和H-Keap1。ATG7或p62的缺失阻止了Sesn2诱导的Keap1降解。
此外，p62的过表达以浓度依赖性方式增强了Sesn2诱导的Keap1降解。
（Rbx诱导的keap1降解，由sesn2增强，需要Clu3间接参与）与之前的观察一致，Keap1的降解是由Rbx1的过表达引起的。在p62+/+MEFs中，M-Rbx1成浓度依懒性降解H-Keap1。P62-/-的细胞中不明显。在sesn2+/+细胞比sesn2-/-的细胞更明显。Rbx1导致的keap1的降解被sesn2增强。
Rbx1与Keap1相互关系由Cul3间接作用。在Cul3缺失时，Rbx1诱导H-Keap1降解作用明显衰减。
Keap1在正常(非应激)条件下通过p62介导的自噬稳定降解。已经证明，p62通过Keap1相互作用域(KIR)和LC3相互作用域(LIR)直接与Keap1和LC3相互作用。在自噬体膜上形成LC3-p62-Keap1复合物可能是Keap1自噬降解的原因。已知Keap1被Cul3-Rbx1泛素化，并经历蛋白酶体独立降解。p62通过其泛素相关(UBA)结构域结合了泛素相关蛋白，并将其导向自噬机制。我们在转染F-Sesn2、H-Keap1和p62野生型或UBA缺失突变载体的HEK293细胞，测试了p62 UBA结构域在sesn2诱导的keap1降解中的作用。p62缺乏UBA结构域并不能阻止F-Sesn2诱导的keap1降解。
然而，在没有F-Sesn2的情况下，P62 UBA结构域缺失，H-Keap1水平比未缺失的高。当M-Rbx1水平升高时，泛素化UBA结构就没那么有必要了。
这些结果表明，当Sesn2或Rbx1的浓度较低时，Keap1与p62相互作用形成LC3-p62-Keap1三元复合物。在Sesn2或Rbx1水平升高时并不需要，可能是因为Sesn2或Rbx1可以增强keap1和p62之间微弱的联系。
（敲除keap1,检测Nrf2信号通路蛋白来验证通路。）为了检测sesn2介导的Keap1降解是否介导Nrf2活化，我们将F-Sesn2、p62和H-Nrf2载体转染Keap1+/+或Keap1-/ -MEFs，并评估了三个Nrf2靶基因:Srx、NQO1和GSTA1的表达水平。Keap1的缺失完全阻断了Sesn2诱导的三种nrf2靶基因的增加。表明Sesn2通过促进Keap1的降解来表达它的抗氧化功能。
3、Sesn2特异性地与p62、Rbx1和Keap1相互作用
为了探索Sesn2是否与p62、Rbx1或Keap1相互作用，我们将HEK293细胞转染p62表达载体，M-Rbx1，或H-Keap1，连同F-Sesn2的载体，然后将细胞裂解物进行共免疫沉淀分析。
为了确定F-Sesn2与p62或M-Rbx1的关联是否通过keap1间接介导，我们在Keap1+/+或Keap1- / -MEFs中研究了它们之间的相互作用。我们在Keap1+/+或Keap1- / -MEFs制备的F-Sesn2免疫沉淀物(图3D)中检测到p62，在M-Rbx1免疫沉淀物(图3E)中检测到F-Sesn2，表明Sesn2与两者之间的相互作用并不是通过Keap1介导。内源性keap1、p62和Rbx1也与f - sesn2共免疫沉淀(图3F)。
F-Sesn2的C125S突变体与异位p62、M-Rbx1或H-Keap1的关系与野生型蛋白相似(图S3A-S3C)。
为了定位与Sesn2相互作用所需的p62、Rbx1、Keap1区域，用HEK293细胞共免疫沉淀分析：M-p62、H-Rbx1、orKeap1的各种缺失突变体的表达载体以及F-Sesn2的表达载体。
Nrf2依赖的抗氧化基因Srx、nqo1和GSTA1 mRNA的表达在夜间禁食后略有增加，在再喂养16小时后逐渐显著增加(分别为10-、8-和12倍)，在36小时后再次下降。我们研究了Keap1降解是否可能导致这些Nrf2靶基因的诱导。免疫印迹分析显示，夜间禁食不影响肝脏Keap1的丰度。然而，keap1的量在再喂养期间逐渐减少，在16小时后达到最低点(非禁食小鼠的水平的40%)，然后在36小时再次增加。（同时关注P62）
与此相反，Keap1 mRNA的数量不受禁食或再喂养的影响。这些结果表明，Keap1蛋白的再摄取诱导下调可能与蛋白质降解有关。
小鼠肝脏中p62的丰度不受夜间禁食的影响，但在开始补饲后6、16小时显著增加，36小时下降。（见上图）相反，Rbx1的量不受禁食或再喂养的影响。
综上所述，小鼠肝脏中Sesn2的丰度在禁食16小时和再进食16小时后均有相似程度的增加，补饲16小时后p62的含量增加，但不是通过通宵禁食，禁食16小时后，Rbx1的表达量和Keap1的降解量没有明显增加，而Nrf2靶基因的表达量在禁食16小时后明显增加，这些观察结果，我们通过p62+/+或p62-/ -MEFs得到的结果表明，p62对于Sesn2诱导的Keap1降解至关重要(图2E和2F)，这表明同时增加Sesn2和p62的浓度对Keap1的降解至关重要。
4、在Keap1降解和nrf2活化过程中需要Sesn2
为了进一步研究内源性Sesn2在Nrf2调控中的作用，我们让Sesn2+/+或Sesn2- / -鼠禁食16小时，然后再喂食16小时。Sesn2+/+小鼠体内Nrf2靶基因的mRNA丰度通过禁食增加到<2倍，但通过再喂食显著增加(Srx增加15倍，NQO1增加8倍，GSTA1增加25倍)。蛋白印迹呈相同的趋势。
这些结果表明，Sesn2的消融导致与再喂养相关的Nrf2活化显著减弱。
如图所示，添加Sesn2+/+的小鼠肝脏中Keap1蛋白的含量降低了50%。但均不影响keap1的mRNA水平。Sesn2消融降低了p62基因的转录。p62基因是Nrf2的靶点。
Sesn2+/+小鼠再喂养诱导p62 mRNA表达量增加。与P62的mRNA相比，P62蛋白在sesn2敲不敲中都增加。在没有Sesn2的情况下降，自噬底物p62解要慢得多，如Keap1。
肝脏中S6磷酸化激活mTORC1，在Sesn2+/+阳性小鼠中，禁食3h后明显降低。阴性小鼠没有。说明，sesn2参与禁食中mTORC的激活。然而，在禁食3、6或9小时后，m TORC1的活性仍然受到抑制，直到16小时后恢复到非禁食对照组小鼠的水平。而在禁食3、6、9或16小时时，sesn2的量随时间逐渐增加。这些结果表明，Sesn2可以抑制m TORC1的活性，
我们通过测量自噬标记物LC3-II来评估Sesn2在自噬体形成中的作用。sesn2 +/+小鼠肝脏禁食3、6小时后LC3-II的含量明显低于Sesn2-/ -小鼠。尽管再喂养显著降低了Sesn2+/+和Sesn2-/ -mice小鼠肝脏中LC3-II的含量，但与Sesn2A / Amice小鼠相比，Sesn2+/+ +小鼠肝脏中LC3-II的含量仍然较高
.这些结果表明，sesn2和P62可以激活选择性自噬，降解keap1，当mTORC1被激活时，自噬被抑制。
5、sesn2诱导的Nrf2激活可保护肝脏免受急性脂肪刺激引起的氧化损伤
禁食后再进食会引起肝脏氧化损伤，通过H&E染色(图6A)、血清ALT水平(图6B)和TUNEL法(图6c和图6D)检测，Sesn2敲除导致肝脏损伤的增加更大。我们通过将Nrf2+/+ 或Nrf2- / -mice置于禁食-再喂养方案中，研究了Nrf2对氧化性肝损伤的保护作用。正如预期的那样，再喂养诱导了Nrf2+/+小鼠肝脏中Srx、NQO1和GSTA1基因的表达，而Nrf2- / -mice则没有。这些结果表明，sesn2依赖的Nrf2激活对保护肝脏免受再喂养引起的损伤至关重要。
为了检测Nrf2过表达是否能挽救Sesn2消融的损伤作用，我们给Sesn2-/ -小鼠尾静脉注射通过腺病毒排出Nrf2 (Ad-Nrf2)或GFP (Ad-GFP)，诱导小鼠肝脏转位，并对小鼠进行再喂养。Ad-Nrf2的活性在Hep-a1c1c7小鼠肝癌细胞中得到了验证。注射Ad-Nrf2，但不注射Ad-GFP，增加了非禁食小鼠和禁食小鼠肝脏中nrf2靶基因的诱导(图7A和图7B)以及细胞核中nrf2的数量(图7C)。
重要的是，Nrf2的过表达降低了Sesn2-/ -miceas再喂养引起的肝损伤的程度,与Ad-GFP相比，表现为更少的肝气球样变性，更低的ALT水平和细胞凋亡率。这些数据证实了Sesn2通过Nrf2的激活保护肝脏免受再喂养诱导的氧化损伤。
DISCUSSION：
Nrf2的活性受Keap1负调控，Keap1是一种富含半胱氨酸的蛋白，通过Cul3-Rbx1 E3泛素连接酶复合物作为Nrf2泛素化的底物适配器。蛋白酶体降解过程中，keap1结合Nrf2，并在非氧化应激时将转录因子维持在低水平。Keap1通过其Kelch结构域与Nrf2的Neh2结构域结合，Keap1的BTB结构域招募Cul3。在本模型中，Keap1的Kelch结构域结合Nrf2的的eh2结构域的低亲和力DLG模体结构 (latch)或高亲和力ETGE 模体结构 (hinge)。在非氧化应激条件下，Keap1与Nrf2的DLG和ETGE基序结合，从而使Nrf2呈现正确的泛素化方向。氧化应激时，keap1结合其他区域，诱导sesn2构象变化，并干扰其直接Nrf2泛素化的能力。因此，Keap1修饰的净效应是Nrf2不再在胞质中降解，能够转位到细胞核并诱导其目的基因的转录。
在本研究中，我们发现sesn2的强迫表达诱导Keap1的降解和nrf2活性的上调，而sesn2诱导Keap1的降解主要是通过自噬而不是蛋白酶体介导的。此外，在p62缺失的情况下，sesn2诱导的Keap1降解被消除，这种现象还被Rbx1过表达所促进。虽然Sesn的作用尚不清楚，但是之前已经报道过通过Keap1降解激活nf2通路，以及Rbx1和p62在Keap1降解中的作用。P62是自噬缺陷细胞中，打破keap1-Nrf2并激活Nrf2的另一种蛋白。自噬受损导致P62积累，P62通过kelch结构域的KIR模体结合于keap1上，P62与Nrf2的ETGE基序相似，因此与Nrf2竞争与Keap1的结合。p62是一种多面性的适配蛋白，通过与多种蛋白质相互作用，促进蛋白质的聚集，实现多种生物学功能。此外，通过其与LC3相互作用的能力，p62调节自噬去除蛋白聚集和受损的细胞内细胞器
虽然已知与p62紧密结合的蛋白会与自噬底物一起降解，但目前的研究中，keap1是否也通过与p62结合而降解，这一点还不清楚。在过表达Keap1的细胞中观察到Keap1的降解，但即使诱导p62降解，在对照组细胞中也不明显。这些观察表明，p62和Keap1之间的相互作用并不强，不足以使Keap1容易受到自噬降解，除非这种解离平衡被keap1的大量聚集所打破。
我们发现了sesn2与P62，keap1,Rbx1的相互作用，证明sesn2过表达可以促进keap1的降解。因此，Sesn亚型似乎可以作为支架蛋白，增强keap1与p62之间微弱的联系。Sesn2和Rbx1 诱导的Keap1降解完全依赖于p62。
为了研究Sesn2在生理环境中的作用，我们将小鼠分为禁食和再喂食。肝脏中sesn2的丰度是通过食物剥夺和再喂养来增加的，但这些增加可能是由不同的机制介导的。补饲增加了p62的含量，而禁食则没有。此外，Sesn2在不同的代谢状态下表现出不同的功能:在近视的情况下，sesn2与p62协同作用，激活mTORC1，促进Keap1自噬降解。基于我们的研究结果以及之前的研究结果，我们提出了一个模型，揭示了sesn2在禁食和再进食期间的丰度和功能的潜在调控机制。
饥饿通过多种机制上调p53和下调TORC1活性，涉及分子应答到代谢改变。我们发现，S6磷酸化反应所反映的mTORC1活性在食物剥夺后3、6和9小时在肝脏中显著降低，但在禁食16小时后恢复到未禁食小鼠的水平。(禁食抑制mTORC1)。禁食相关的自噬作用抑制mTORC的降解，但是自噬降解导致氨基酸的积累会重新激活mTORC。禁食后，sesn2-/-小鼠，mTORC活性及自噬 都被抑制。基因毒性应激通过激活p53抑制m torc1信号转导;Sesn2对p53的这种作用至关重要。Sesn2 与AMPK, TSC1和TSC2等形成复合体，激活AMPK，使TSC2磷酸化，因此也解释了P53相关的mTORC1抑制所介导的DNA损伤。我们发现Sesn2的基础水平足以下调AMPK-TSC1/TSC2-mTORC1通路，而Sesn2的进一步积累并不能增强这一作用。
禁食小鼠肝脏中Sesn2的诱导可能是能量传感器AMPK和转录激活因子PGC1a下游的p53活化增加的结果。
16小时不进食的老鼠肝脏中Sesn2的含量略高于复喂16小时的老鼠，Sesn2的上调伴随着Keap1的降解，但前者没有，可能是因为p62的含量是通过再喂养而不是禁食来增加的。禁食通过p53、AMPK和mTORC1等多种机制激活大自噬，以提供额外的能量来源。尽管禁食后sesn2蛋白含量上调，通过阻断mTORC信号通路激活自噬，但keap1的含量并没有降低。这一发现表明Keap1的降解不是通过宏观自噬，而是通过高度选择性的自噬。可能由于keap1降解与P62和一定量sesn2的存在。.禁食时肝脏keap1降解的缺失和ROS生成的缺乏，与此相一致的是Nrf2的激活也很小。在饥饿条件下，P62不太可能降解，激活其转录基因再供给已经没必要。观察表明，禁食不影响p62 mRNA的水平。
禁食后用高碳水化合物、无脂肪的饮食喂养老鼠，会引起肝脏中脂肪酸的积累，从而引发急性脂肪生成反应。肝细胞内的脂肪酸代谢导致活性氧的产生。因此，小鼠肝脏中mTORC1的激活和随后脂肪酸的积累可能触发ROS-FOXO通路，诱导Sesn2的表达。我们发现，再喂养诱导小鼠肝脏内质网应激，提示通过再喂养诱导Sesn2表达，除ROS-FOXO通路外，还可能通过m TORC1、内质网应激和C/EBP的顺序激活介导。小鼠肝脏p62水平的明显升高也可能与m TORC1活性的上调有关。激活的m TORC1减弱自噬，导致p62的积累。另一方面，通过FOXO和c /EBP信号诱导的p62和Sesn2的累积可能会将Keap1隔离在自噬体上，从而促进Keap1的降解，从而激活Nrf2。同时，p62基因是nrf2的靶基因，p62积累和Nrf2激活，从而构成一个正反馈回路。从我们的观察中可以明显看出，在Sesn2- / -mice中，通过再喂养诱导Nrf2靶基因的诱导作用明显减弱。
在Sesn2+/+小鼠肝脏中，通过再喂养，p62 m RNA的含量显著增加，而在Sesn2- / -mice中则没有显著增加。这一发现可以解释为，p62基因是Nrf2的一个靶点，在Sesn2+/+小鼠中，再喂养显著激活Nrf2通路，而在Sesn2- / -mice中没有。尽管补饲对sesn2 +/+和Sesn2- / -mice中p62 m RNA水平的影响不同，但通过补饲两种基因型的小鼠，p62蛋白的数量都有相似程度的显著增加。尽管在进食后抑制自噬，自噬处于低水平，但是当营养充分时，蛋白的自噬降解会上调。考虑到Keap1降解与自噬底物p62的降解相关，肝脏P62mRNA的合成对补充P62的丢失是极其重要的。在Sesn2- / -mice的肝脏中，p62 mRNA未上调，但p62的丰度明显增加，与sesn2 +/+小鼠相似，可能是由于sesn2缺失，keap1的降解（同时伴有P62的降解）被阻断，而P62仍然可以继续合成。事实上，再喂养诱导的Keap1降解在Sesn2+/+小鼠中发生，但在Sesn2- / -小鼠中没有发生，尽管这些动物的p62蛋白水平相似。这进一步支持了这样的观点，即p62的积累是不够的，sesn2蛋白的支架功能对于这种效果是必不可少的。
喂食高碳水化合物的老鼠会在肝脏中积累脂肪酸，导致大量活性氧的产生。为了抗活性氧的产生，细胞通过激活Nrf2相关的信号通路产生Srx等抗氧化酶。我们在Sesn2- / -和Nrf2- / -小鼠，补充高碳水化合物后不能诱导这些抗氧化酶产生，导致严重的肝损伤，表现为气球变性、血清ALT水平和凋亡细胞死亡的增加等。此外，Nrf2的异位表达降低了inSesn2- / -mice的肝损伤程度。因此，我们的观察表明，sesn2依赖的Nrf2激活对保护肝脏免受急性脂肪刺激损伤至关重要。此外，我们的数据表明，Sesn蛋白的抗氧化应激功能是由于其促进Keap1 p62依赖性的自噬降解，和Nrf2的激活。
