Introduction
在这项研究中，我们使用scRNA-seq、ST和HybISS分析了16个人类胚胎和胎儿脊髓样本，这些样本的年龄跨度从怀孕后5-12周(W)开始，并将这些数据集与先前报道的小鼠和人类脊髓数据集整合在一起。在这里，我们提供了一个全面的人类脊髓发育细胞图谱，揭示了时空基因的表达和细胞命运承诺的调控，强调了人类和啮齿动物脊髓发育过程中细胞和分子事件的主要差异，并报道了儿童脊柱肿瘤干细胞(Cscs)新的分子靶点和基因调控的发现。
Results
1. Comprehensive atlas of the human developing spinal cord
a, Schematic overview of the workflow.
发育中的人类脊髓的样本：时期为产前W5-12，样本数16条；涵盖了妊娠早期中枢神经系统的细胞命运决定。进行了scRNA-seq，ST和HybISS建立了人类脊髓发育细胞图谱，具有详细的时空基因表达和验证。
b, UMAP of scRNA-seq datasets revealing major cell populations.
分析了31个scRNA-seq文库中的159,350个高质量细胞，揭示了47个细胞簇。
NPCs, intermediate neuronal progenitors (INPs), excitatory neurons (ExNs), inhibitory neurons (IbNs), cholinergic neurons (ChNs), astrocytes (ASCs), ependymal cells (EPCs), oligodendrocyte precursor cells (OPCs) and oligodendrocytes (OLs), Schwann cells (SWCs), pericytes (PCs), endothelial cells (ENs), vascular capillary endothelial cells (VCLPs) and immune cells (Immune).
c, Dot plot illustrating top marker genes for major cell populations. 基因marker展示
d, Spatial mapping of major cell types from ST analysis in representative human spinal cord sections.
确定基因的空间表达和细胞类型定位，在W5，横切面的人脊髓被脑室区域的神经前体细胞所支配。从W8到W8以后，神经元以及所有胶质细胞类型都被发现。
e, Representative stereoscope plots of one W12 section.
利用stereoscope整合了scRNA-seq和ST数据，这是一种以scRNA-seq数据为参考对ST数据进行指导分解的方法，以描绘scRNA-seq中定义的细胞类型的空间分布。
在这里对W12的切片进行注释，这里的细胞类型是相对概率而不是绝对值。
stereoscope文献参考：Single-cell and spatial transcriptomics enables probabilistic inference of cell type topography.
f. Representative images and cell typing results from HybISS.
利用pciSeq整合了scRNA-seq数据与HybISS数据，并证实了ST(图1F)的发现。
下文中，也利用ST或HybISS数据独立进行了分析作为验证。
总结：这张图告诉我们样本来源，聚类了注释了细胞类型，然后把rna的数据于空间转录和原位整合，发现结果是相符合的，有不错的空间信息。
2. Diverse neural cells in the human developing spinal cord
a, Representative images showing validation of newborn neurons and glial cells in the developing human spinal cord by HybISS.
根据原位测序的信息，找到细胞类型的marker看具体分布，在第五周的时候神经前体细胞占主要类型，并且高增殖；而在第八周的时候神经前体细胞主要限制在脑区室中。神经元在第五周初现，在第八周广泛分布于中间区也就是灰质。胶质细胞在第五周也出现了，不同胶质细胞的分布也有不同分区，并且都有增殖，表明叫胶质发生的时间在W5-8就有。
b, Representative confocal images showing immunostaining of newborn astrocytes (b) and ependymal cells (c) at W5, whereas OPCs are not born at W5 yet (d).
根据免疫组化，对特定细胞类型的marker染色，发现细胞的定位与原位测序的结果一致，但是少突胶质细胞在第五周并没有蛋白marker，但在a图中看出是有rna的，可以初步说明第五周的时候刚开始胶质形成，表明早在发育中的人类脊髓中，NPC就致力于神经胶质的命运决定。
e, UMAP illustrating the heterogenous cell types or cell states of different neural cell populations.
对不同神经细胞亚群再聚类，揭示他们的多样性，同时在扩展图内也有亚群的位置信息，原理同上。
总结：这部分揭示了神经细胞的多样性，以及他们的空间定位。
#. NPC commitment to neural fates at early stages
这部分通过对扩展图等等合在一起说明神经前体细胞在分化中的作用，比如神经前体细胞的在早期发育进入静止。
3. Spatiotemporal gene expression regulates neurodevelopment
a, UMAP displaying branches from NPCs to different neuronal clusters, confirmed by RNA velocity (left upper panel). Lighter colors indicate undifferentiated states; darker colors indicate differentiating states.
NPC的分化轨迹，分化过程中都有特征基因表达。
b, HybISS revealing the co-location of NPCs, neuronal markers and lineage-related genes revealed by trajectory analysis.
NPC的marker与三类神经元谱系相关基因具有共定位。
c, Integrated trajectory and ST data revealing neuronal spatial differentiation.
NPC向各种神经元分化过程中，先分化为中间神经前体细胞。不同神经元谱系的细胞空间分布不同
d, Spatial quantification of neuronal lineage-associated gene expression along the DV axis across ages.
谱系相关基因在背腹轴的表达，证实了不同谱系神经元细胞在空间上的分布。不同时间也暗示分化的时间
PBX3是三种神经元中都表达的，因此从第八周开始就没有特异性了，表明神经元的分化在第八周已经遍及背腹轴，与上面的结论相似，第五周神经元初现，第八周广泛分布于中间灰质。
e, UMAP indicating branches from NPCs to different glia, confirmed by RNA velocity (upper panel).
所有三种胶质细胞谱系都起源于一种常见的 NPC 亚型，且具有特征基因
f, HybISS revealing the co-location of NPCs, glial markers and lineage-related genes.
NPC与胶质谱系细胞的共定位
g, Integrated trajectory and ST data revealing glial spatial differentiation.
不同胶质谱系细胞的分布不同
h, Spatial quantification of the expression of glial lineage-associated genes along the DV axis across ages.
谱系相关基因在背腹轴的表达，证实了不同谱系胶质细胞在空间上的分布。不同时间也暗示分化的时间，比如新生ASC和EPC在第八周前就出现，而OPC在第十二周成熟。
总结：这部分探究神经前体细胞的分化，在时空上具有特异性，这部分属于是发现这个现象。
4. Genetic regulatory networks of spinal cord development
a,b, Dot plots illustrating the expression of the three major signaling pathways involved in spinal cord development in different cell types (a) and their decreasing expression during development (b). Max = highest expression of the given gene or module; Min = 0.
三大常见神经模式信号通路，发现WNT、Notch和SHH信号的基因模块在大多数细胞类型中都有表达，但总体上随着时间的推移而减少。
c, Representative confocal images of immunostained ABC and SHH during human spinal cord development from W5 to W12.
active-β-catenin (ABC)为WNT通路的主要分子，ABC和SHH在脑室区的RF和FP表达，随时间减弱；根据拓展数据，NOTCH的HES1在脑室区整个一圈高表达。
d, HybISS showing neuronal and glial progenitor patterning. Two independent experiments for each panel (c and d) were performed.
在SHH和WNT等形态原的梯度下，与神经发生和胶质发生相关的基因在W5和W8表现出空间特异性的表达模式，这与其相关分化细胞类型的空间位置一致。
e, Examples of spatial quantification of neural patterning genes along the DV axis across ages. Scale bar, 100 μm.
i量化背腹轴空间基因表达模式，表明空间上面基因就出现分化，证明上面提到的神经元和胶质谱系的分化的时间空间特异性。
f, Circos plots displaying co-localization and major connections of different cell types during development. Solid lines, neurons; dashed lines, glia.
在发育过程中，NPC的比例显著下降。不同细胞类型之间的主要联系表明，W5的NPC分化为神经元和胶质前细胞，W8的局部神经发生和胶质形成先于迁移。在W12，神经元和胶质细胞之间的强烈联系表明，主要事件已从NPC分化转移到神经回路的形成。
总结：在基因和通路层面探究了神经前体细胞分化为神经元和胶质的时空特异性，这部分属于是深入探究这个现象的机制，但也没很给出具体机制是什么，给出了一个方向，需要后来实验去探究。
5. Comparison of mouse and human spinal cord development
a, UMAP illustrating integrated scRNA-seq datasets of human and mouse spinal cord development. Li2022: dataset in this study. Other two datasets: publicly available mouse development datasets.
整合两个老鼠的脊髓数据做比较
b, Violin plots displaying normalized gene expression of proliferation markers MKI67 and TOP2A as well as stem cell quiescence regulator LRIG1 during mouse and human spinal cord development.
鼠的增殖marker的高表达，人的静止调节因子高表达（比较而言），说明在鼠中的NPC增殖特性是不同于人类的。
c, Representative confocal images illustrating proliferative human and mouse NPCs at early stage. Two independent experiments were performed. Scale bar, 100 μm.
免疫组化揭示SOX9的hNPC在第五周并没有增殖特性，mNPC具有；说明人类NPC在早期发育进入静止期。
d, Violin plots displaying species differences in gene expression of gliogenesis regulators.
在人类中，MSX1致力于ASC和EPC的命运决定，而在小鼠中，MSX1只对EPC起作用；GFAP是已知的只作用于人类的ASC marker；FOXJ1是小鼠和人中都表达的作用于EPC的基因；GLIS3 和 NKX6-1分别致力于人类 ASC 和人类 EPC 。
e, ST plots displaying human–mouse species differences of spatial gene expression of gliogenesis regulators in the developing spinal cord.
空间转录组的数据验证GFAP与MSX1在人类中的共定位和表达；FOXJ1和MSX1在小鼠中的共定位和表达；证实GLIS3与人类而非小鼠发育脊髓中的GFAP区域相关。
总结：尽管机制保守，但小鼠和人类脊髓发育之间的时空基因表达存在根本差异。
6. Neurodevelopment reveals tumor-specific gene expression
a, ST plots displaying spinal cord tumor gene module expression.
从HPO数据库获得脊髓肿瘤相关基因，在ST中观察，发现脊髓肿瘤基因模块的广泛但非区域特异性表达。这表明人类正常发育中的脊髓中的许多细胞类型与肿瘤有相似之处。
b, UMAP displaying integrated normal human spinal cord and ependymomas scRNA-seq datasets.
将儿科室管膜瘤的单细胞数据整合一起，有不少部分重叠。
c–e, Clusters of neuronal populations shared between conditions (c) and the expression of normal neuronal markers (d) and tumor-specific markers (e).
神经元和肿瘤细胞聚类，展示它们之间的marker，可以看出神经元的marker完美特征了神经元，没有肿瘤部分。可能暗示该肿瘤并不是神经来源性的。
f–h, Clusters of glial populations shared between conditions (f) and the expression of normal glial markers (g) and tumor-specific markers (h).
展示胶质细胞与肿瘤细胞的marker，胶质的一些marker中还是有肿瘤细胞的表达，可能暗示部分肿瘤细胞是来源。
i–k, Clusters of progenitor populations shared between conditions (i) and the expression of normal stem cell markers (j) and tumor-specific markers (k).
展示神经前体细胞与肿瘤细胞的marker，前体marker有不少肿瘤细胞表达，特别是cluster3、6、7，又是增殖性，又是NPC和Tumor来源；找到了两个肿瘤marker，在hNPC中不表达，可能成为室管膜瘤 CSC 的新治疗靶点。
l–n, Trajectory analysis of EPC-like cells (l) and lineage-associated gene expression along pseudotime (m) or among branch-related clusters (n).
EPC 相关的 TF RFX2 和 RFX4 与 EPC 分化高度相关，在正常EPC和EPC样CSC都有表达；NLRP1和VWA3B分别与正常EPC和EPC样CSC的分化特异性相关，可以凭此将这两类细胞分开，或许这可以指示肿瘤的发生。
o–r, Trajectory analysis of ASC-like and OPC/OL-like cells (o) and lineage-associated gene expression along pseudotime (p) or among branch-related clusters (q–r).
WLS 和 APOD 分别与 ASC 和 OPC 群体（正常和肿瘤）的分化相关；正常胶质细胞和胶质细胞样肿瘤细胞具有其特定的谱系相关基因，例如正常ASC中的FABP7和MSX1、正常OPC和OL中的OLIG2和OPCML；ASC样室管膜瘤中的FRMD5和OPC/OL样室管膜瘤中的GLUL，可以揭示室管膜瘤的起源。
总结：根据整合室管膜瘤数据，将正常细胞与肿瘤细胞对比，观察到一些肿瘤细胞有可能是起源于某一部分的胶质细胞，并且给出了正常细胞与肿瘤细胞的marker，为治疗提供方向。
7. An integrated spinal cord atlas across rodents and humans
a–c, UMAP illustrating the integrated spinal cord scRNA-seq dataset with cell types (a) and across datasets (b) and developmental stages (c).
数据整合，根据细胞类型，数据来源，时期注释。
d, Dot plot illustrating cell proportions across different species, developmental stages, cell capturing chemistry and technologies.
各个数据的基本信息，包括物种，时期，平台，技术。
Discussion
利用多组学和数据集成来研究发育中的人类脊髓，（1）创建了整个发育前三个月的人类脊髓发育细胞图谱； (2)揭示了人类脊髓神经发生和胶质细胞发生的时空调控； (3) 展示了啮齿动物和人类脊髓发育之间细胞和分子调控的主要差异； (4) 发现人室管膜瘤中 CSC 分化的独特标记和调控
整合了多组学数据集为发育中的人类脊髓的时空基因表达提供了新的见解。
人们认为 NPC 在胎儿发育过程中会大量增殖。然而，我们发现整个心室区的许多 hNPC 即使在早期胚胎阶段也没有增殖。人类的增殖性 NPC 在妊娠前三个月就失去增殖能力，比啮齿类动物要早得多。胎儿发育后活性 NPC 的丧失限制了哺乳动物成年脊髓的再生，例如脊髓损伤。
通过整合多组学数据，我们强调了人类发育脊髓中的一些独特发育事件。
首先，我们发现 hNPC 早在第 5 周就致力于胶质细胞命运，而之前对活性调节子和标记表达的研究表明，这种情况发生在第 8-10 周。
其次，人类的星形胶质细胞首先被限制在脊髓背侧区域，并受到MSX1的时空调节，MSX1是一种特异性调节啮齿动物室管膜细胞发育的TF。
然后，人类室管膜细胞的发育周期比预期的要长。小鼠脊髓室管膜细胞来源于胎儿期中晚期(E15.5)，在体内1 周内发育完全。然而，虽然人类室管膜细胞来自W5腹侧，但成年时发现的背侧室管膜细胞在W12仍然缺失，这表明在妊娠中期出现了第二波胶质形成。
最后，我们应用人类脊髓发育图谱来研究儿科脊髓室管膜瘤的基因表达，这种癌症类型的复发率很高，可能是由于耐药 CSC 的增殖所致。通过数据整合，我们确定了 CSC 和正常细胞之间基因表达的最显着差异。我们的结果为室管膜瘤诊断和治疗的潜在靶点提供了新的见解。
