作者，Evil Genius
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知识积累
具有肿瘤血栓的肾细胞癌（RCC-TT）的术前降期使得血栓切除术可行。然而，治疗抵抗现象普遍存在，部分原因可能归因于肿瘤微环境（TME）的促肿瘤作用。
肾细胞癌（RCC）是全球最常见的十种癌症之一，约有15%的RCC患者表现出一种独特的临床特征：肿瘤细胞倾向于侵入肾静脉或下腔静脉，形成肿瘤血栓（TT）。
有研究者提出通过靶向治疗和免疫治疗进行术前TT降期。据报道，这些新辅助全身疗法成功减轻了部分RCC-TT患者的TT负荷，但在其他患者中却无效。
结果1、共识聚类识别出两种临床不同的RCC-TT分子亚型
北京大学第三医院（PUTH）队列（包含40对PT-TT样本的元数据集）。
基于这40个TT的RNA测序（RNA-seq）数据的共识聚类分析表明存在两个具有不同基因表达谱（GEP）的亚类，此后分别称为I型（TT1，n=21）和II型肿瘤血栓（TT2，n=19）。
结果2、RCC-TT分子亚型展现出不同的ECM重塑能力
基因集富集分析（GSEA）显示，TT2与脂肪酸和氨基酸代谢等代谢特征相关，而TT1则显著富集于多种细胞外基质（ECM）相关过程，包括胶原合成、胶原纤维组织和局灶粘连。
TT1还富集了涉及血小板活化和聚集的生物学过程，这与在TT1患者中观察到的升高的血小板计数一致。因此检查了巨核细胞（MK）活性。确实，TT1表现出最高的MK表达特征，这可能与前血小板形成有关，表明MK、血小板和肿瘤微环境（TME）之间存在可能的相互作用。此外，TT1中增加的血小板活性可能由血小板粘附到暴露的胶原上而促进，这可能是结缔组织增生激活的结果。
除了结缔组织增生激活，TT1还具有高度增殖性和恶性，上调了与有丝分裂纺锤体、E2F靶点和上皮-间充质转化（EMT）相关的基因。
对PUTH和西方RCC-TT队列的全外显子组测序（WES）显示，与TT2相比，TT1表现出稳定性较差的基因组，富集了全基因组倍增（WGD）事件。这些肿瘤还展现出与匹配PT相似度较低的拷贝数变异（CNA）图谱，考虑到它们的高增殖特征和Mayo分级，这可能预示着快速的克隆扩增。此外，TT1中更频繁的CNA包括9p缺失（转移性RCC的标志）以及随后CDKN2A（位于9p21）的拷贝数丢失。然而，TT亚型之间的体细胞突变差异有限。在TT1和TT2中，最常发生改变的基因是著名的VHL。除VHL外，我们在PUTH数据集的TT1组中观察到PTEN和SETD2突变更普遍。
结果3、肿瘤细胞是TT1表型的主要驱动因素
单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集，包含TT1和TT2 RCC-TT样本、匹配的PT以及癌旁正常组织（ANT）。
细胞组成差异：
TT1特征：与TT2相比，TT1组显著富集成纤维细胞，但内皮细胞比例较低。这符合TT1肿瘤的结缔组织增生性质。
TT2特征：TT2组则与VEGF-沙漠型免疫特征的主导地位一致。
其他细胞类型：反卷积分析预测TT1组中中性粒细胞、巨噬细胞和CD8+ T细胞等非上皮细胞可能扩增，这与WES数据推断的较低肿瘤纯度及TT1患者血液中中性粒细胞计数升高相符。
关键基因的细胞来源归属：
通过整合bulk RNA-seq和单细胞数据，筛选出69个可归因于特定细胞类型的亚型差异表达基因（ctDEGs）。
成纤维细胞驱动：TT1中胶原基因的上调主要由成纤维细胞驱动。
肿瘤细胞驱动：基因 TRIB3、LBP、LOX 和 FGA 在TT1中的高表达完全归因于肿瘤细胞，且这些基因的高表达与TCGA队列中较差的无进展生存期（PFS）显著相关。
预后相关基因：在TT1肿瘤细胞中下调的基因（如 NAT8、SLC17A3）则与RCC患者良好的预后相关。
构建TT1特征评分：鉴于大多数ctDEGs源自肿瘤细胞，研究者专门利用源自肿瘤细胞的ctDEGs构建了一个TT1特征评分。该评分在多个独立队列中均能有效区分TT1与TT2，TT1组的评分显著更高。
结果4、上皮细胞LOX表达赋予TT1 ECM重塑能力
肿瘤细胞异质性与TT1/2分化轨迹
细胞异质性：正常细胞表达程序均一，但肿瘤细胞在转录组和CNA模式上存在显著的瘤间异质性。
分化轨迹：通过伪时间轨迹分析，近端小管细胞处于根部，而TT1和TT2肿瘤细胞分别走向两个不同的命运分支，对应不同的表达程序。
LOX在TT1中的特异性表达与来源
动态激活：TT1肿瘤细胞在分化轨迹中动态激活了LOX基因（编码赖氨酰氧化酶），该酶对胶原交联和ECM成熟至关重要。
临床相关性：LOX上调与患者较差的生存率显著相关。
细胞来源澄清：多重免疫组化（mIHC）和单细胞数据一致证实，在RCC中LOX的主要来源是肿瘤细胞，而非传统认知中的成纤维细胞。
LOX过表达的上游调控机制
主调控因子筛选：通过转录活性分析，筛选出与LOX共表达最显著的主调控因子CEBPB。
功能验证：
- 敲低实验：在786-O和ACHN细胞中敲低CEBPB，导致LOX表达降低。
-
结合验证：ChIP-qPCR实验证实CEBPB可直接结合到LOX启动子的预测位点上。在LOX本底表达较高的ACHN细胞中，这种结合作用更强，解释了其高表达的原因。
LOX阳性肿瘤细胞的表型特征
LOX- vs LOX+：
- LOX-细胞：表达近端小管特征基因（如NAT8），与低度恶性肿瘤相关。
- LOX+细胞：上调EMT、纤维蛋白原基因（FGA/FGB）和蛋白交联酶（PLOD2/TGM2），重现了TT1的ECM形成等转录程序。
LOX驱动ECM重塑的功能验证
体外ECM系统：利用人包皮成纤维细胞（HFF）产生的ECM系统培养RCC细胞。
LOX功能：表达LOX的RCC细胞诱导了胶原交联和纤连蛋白组装。
干预效果：敲低LOX或使用抑制剂BAPN可显著削弱这种ECM重塑能力；而过表达LOX则增强基质组装。
结论：TT1 RCC-TT的ECM重塑能力直接由升高的上皮细胞LOX表达驱动。
结果5、抑制LOX对肾细胞癌（RCC）细胞恶性行为的影响
抑制LOX对RCC细胞恶性表型的影响（体外实验）
抑制增殖：使用LOX家族抑制剂BAPN处理RCC细胞，可剂量依赖性地有效抑制细胞增殖。
抑制迁移：体外划痕实验表明，抑制LOX（使用BAPN或敲低LOX）显著削弱了RCC细胞的伤口愈合能力（迁移能力）。
抑制侵袭：Transwell实验显示，抑制LOX显著减弱了RCC细胞（769-P、786-O、OS-RC-2）穿过基质胶的侵袭能力。
抑制降解：明胶降解实验表明，抑制LOX有效降低了OS-RC-2细胞对细胞外基质明胶的降解能力。
过表达LOX的促癌作用
功能获得验证：在LOX本底表达较低的769-P细胞中过表达LOX，则增强了细胞的增殖和迁移能力，从反面印证了LOX的促癌作用。
体内验证
动物模型：利用原位植入Renca细胞（表达LOX）的小鼠模型进行验证。
抑制肿瘤生长：给予BAPN处理显著抑制了小鼠体内RCC肿瘤的生长。
结果6、肌成纤维细胞和促纤维化巨噬细胞如何通过相互作用增强ECM重塑
THBS2+ 成纤维细胞的鉴定与特征
细胞亚群识别：通过无监督聚类，在成纤维细胞中识别出一个特异性高表达THBS2和免疫抑制标志物FAP的亚群。
TT1富集与预后：THBS2+成纤维细胞在TT1 RCC-TT及TT1样PT中显著富集，其丰度与不良临床结局相关。
细胞起源与表型：细胞轨迹分析显示，THBS2+亚群可能起源于周细胞，位于分化终末段，表现出产生ECM的肌成纤维细胞（ECM-myCAF）和疾病相关表型。
GPNMB+ 巨噬细胞的鉴定与特征
细胞亚群识别：在髓系细胞中，发现一个GPNMB+的M2样巨噬细胞群在TT1组中扩增。
促纤维化作用：该亚群共表达SPP1、GPNMB和FABP5，重现了“疤痕相关巨噬细胞”（SAM）的促纤维化作用。
预后关联：该TAM亚群的富集同样与患者生存率降低相关。
细胞间互作网络与正反馈环路
强化的互作关系：基于scRNA-seq的细胞通讯分析显示，与TT2相比，TT1中LOX+肿瘤细胞、THBS2+ CAFs和GPNMB+ TAMs之间存在更强的推断相互作用，且这些互作富集于ECM相关基因。
信号调控方向：
CAFs/TAMs对肿瘤细胞的影响：THBS2+ CAFs和GPNMB+ TAMs高表达TGFB1、TGFB3、OSM等配体，可能通过LOX+肿瘤细胞表达的受体（TGFBR1、IL6ST）触发LOX和CEBPB的表达，从而增强肿瘤细胞的ECM重塑能力。
肿瘤细胞对CAFs/TAMs的影响：LOX+肿瘤细胞表达的配体可能调控THBS2+ CAFs中胶原/纤连蛋白基因的表达，以及GPNMB+ TAMs的M2相关特征（如SPP1、CTSD）。
结论：这三类细胞之间可能形成一个正反馈前馈环路，共同增强TT1 RCC-TT中的ECM重塑并维持免疫抑制状态。
结果7、LOX+肿瘤细胞、THBS2+ CAFs和GPNMB+ TAMs在TT1肿瘤组织中的空间共定位关系
样本：利用10x Visium平台对3个预处理ccRCC-TT组织切片（ST1-3，均具有高TT1特征评分）进行测序。
互作预测：通过stLearn方法识别NicheNet分析预测的细胞间配体-受体相互作用（如TGFB1-TGFBR1）的显著空间 spots。
细胞定位：使用Redeconv方法将单细胞类型映射到空间 spots上，并通过CopyKAT推断CNA模式来划分肿瘤区域。
细胞共定位的空间位置
组织分区：将组织切片划分为肿瘤巢和巢周区域。
主要发现：三种细胞的共定位现象频繁发生在肿瘤巢的前沿（nest fronts）。
共定位的量化分析
量化指标：为每个 spot 计算了三种细胞类型的共定位指数（加权均匀度）。
区域细分：沿肿瘤巢由内向外将组织分为内部（inner）、前沿（front）和远端（distal）亚区。
量化结果：
共定位指数在肿瘤巢前沿亚区可能增强，尤其在TT1评分最高的ST1样本中最为明显。
Bulk RNA-seq反卷积分析验证了这一发现：TT1/TT1-PT样本的共定位指数显著高于TT2对应样本。
总结一下
LOX+肿瘤细胞、THBS2+ CAFs和GPNMB+ TAMs优先共定位于肿瘤巢前沿。
这种空间上的共定位可能是它们之间相互作用、促进TT1特异性结缔组织增生（desmoplastic activation）的先决条件。
结果8、GPNMB+ TAMs、THBS2+ CAFs和LOX+肿瘤细胞的空间共定位如何导致CD8+ T细胞排斥，以及靶向LOX如何破坏这种屏障并克服治疗诱导的表型可塑性
空间共定位与CD8+ T细胞排斥
免疫排斥现象：TT1组中，促纤维化细胞（LOX+肿瘤细胞、THBS2+ CAFs、GPNMB+ TAMs）在肿瘤巢周围共定位，形成物理屏障，将CD8+ T细胞排斥在肿瘤巢外（局限于巢周区域）。
多技术验证：通过空间转录组（ST）、Visium HD和多重免疫组化（mIHC）在多个队列中验证了这一现象。共定位指数高的肿瘤，其CD8+ T细胞更多被排斥在肿瘤边缘。
临床相关性：在CheckMate 025等免疫治疗队列中，基线共定位指数高的患者，接受免疫检查点抑制剂（ICIs）治疗后生存期更差。
靶向LOX联合免疫治疗的协同效应
治疗假设：鉴于三种细胞的相互依赖性，抑制LOX可能破坏肿瘤免疫屏障（TIB），促进CD8+ T细胞浸润，增敏免疫治疗。
体内模型验证：
原位肿瘤模型：抗PD-1联合LOX抑制剂BAPN治疗显著抑制肿瘤生长，效果优于任一单药治疗。
肺转移模型：联合治疗显著减轻了肺转移负荷。
机制解析：
T细胞活化：联合治疗显著提升了CD8+ T细胞的活化标志物和效应分子表达。
屏障破坏：mIHC证实，联合治疗显著促进了CD8+ T细胞向肿瘤巢内的浸润，并将TIB强度降至基线水平。
治疗诱导的表型可塑性及LOX抑制的逆转作用
不良现象发现：在对照组或抗PD-1单药治疗组中，意外观察到TIB增强和EMT上调，提示治疗本身可能诱导了不利的表型变化。
临床数据分析：
TKI治疗：接受TKI治疗的患者，其肿瘤共定位指数升高，EMT和ECM信号上调，且部分肿瘤发生TT2向TT1的转化。
新辅助治疗：接受TKI或TKI联合抗PD-1治疗后的RCC-TT样本，几乎全部转变为TT1亚型，共定位指数显著增加。
LOX抑制的逆转作用：
在动物模型中，联合使用BAPN可显著下调由抗PD-1治疗触发的EMT和ECM相关信号。
结论：靶向LOX不仅能增敏免疫治疗，还能克服治疗诱导的促纤维化表型可塑性。
最后来看看方法
基因组
visium部分
visium HD部分
