【Stork-20230130】

Microbial network

溶解的有机物和微生物群落之间的相互作用被微塑料和热浪所改变

溶解性有机物(DOM)广泛存在于天然水体中,通过微生物相互作用在河流碳循环和温室气体排放中发挥着重要作用。然而,关于DOM -微生物在响应环境压力方面的关联的信息是有限的。河流环境是微塑料污染(microplastic,MP)的主要载体,全球热浪(Heat waves,HW)正威胁着河流生态。在这里,通过MP暴露和HW模拟实验,我们发现DOM的分子量和芳香度与初始微生物群落密切相关。此外,MP来源的DOM作为决定因素调节微生物群落的丰度和多样性,影响微生物演替轨迹,并与河流DOM竞争微生物利用。模拟HWs增强了MP衍生的DOM竞争优势,并促使微生物群落采用k策略来有效地倔强地利用碳。相对于单一环境应激源暴露,MP污染和HWs联合导致微生物网络更加不稳定。本研究探讨了MPs和HWs如何驱动河流DOM -微生物相互作用,有助于深入了解河流DOM的命运和微生物群落演代过程,并缩小了了解受人类活动和气候变化影响的水生生态系统碳汇的知识差距。

highlights

• DOM解释了微生物群落中43.17%的变异。

• 高分子量和芳香DOM驱动了多样化的微生物群落。

• MPs抑制DOM的生物利用度。

• HWs促进了MP衍生的DOM的微生物利用。

• MPs和HWs提高了微生物对难降解碳的利用。

statistical analyses

• dismo包用于Aggregated boosted tree (ABT)分析,来研究物理和化学性质对于细菌和真菌群落影响的重要性

基于现有研究,细菌中,α-Proteobacteria视为相对K策略者,β-proteobacteria, γ-proteobacteria, and Bacteroidetes视为典型策略者。真菌中,BasidiomycotaAscomycota分别被认为是r和 K策略者。比基于二者物种丰度计算r-K比例

conclusion

DOM是水生生态系统中最大的碳库之一,其循环动态受微生物的调控。然而,MP污染和HWs等不断增加的环境压力威胁着这一过程,迫切需要了解DOM与微生物之间的耦合如何响应MP污染和HWs。我们发现高分子量高芳香性的DOM有助于较高的微生物群落多样性。MPs可作为影响微生物群落演替和抑制DOM生物利用度的决定性因素。虽然HWs的叠加增强了MP衍生碳源与DOM争夺微生物群落利用的竞争力,但HWs****也促进了DOM****中顽固成分的降解和利用。微生物群落可以通过调节代谢模式和群落组成来积极应对环境压力,但MPs****和HWs****的双重作用降低了微生物群落的复杂性和稳定性。MPs和HWs在DOM与微生物分解者相互作用中的影响作用,为了解气候变化作用下河流的生化循环和碳汇提供了参考。

ARGs

预处理在厌氧污泥消化中处理抗生素耐药基因中的作用

污泥是抗生素耐药基因(ARGs)最重要的储存库之一,利用污泥会造成潜在的环境风险。目前,厌氧消化(AD)可以有效地同时实现资源回收和污染物去除,包括抗生素耐药基因(ARGs),并通过各种预处理来提高性能。近年来,大量文献关注预处理对ARGs去除的影响,但得到的结果往往相互矛盾,必须全面了解预处理对ARGs去除的研究进展和机理。本研究总结了提高AD效率和减少ARGs的各种预处理技术,研究了预处理联合AD去除ARGs的潜在性能,并分析了影响ARGs命运的潜在机制。结果表明,虽然热水解预处理在预处理过程中对****ARGs****的还原效果最好,但在随后的AD****过程中,ARGs****会出现明显的反弹。相反,臭氧预处理和碱预处理对预处理阶段ARGs丰度无显著影响,但在后续AD中可提高15.6~24.3%的ARGs去除率。从效率和经济效益来看,游离亚硝酸盐预处理是一种可行的方法,其甲烷产量和ARGs去除率分别可提高27%和74.5%。目前,在预处理和AD过程中,决定ARGs命运的因素包括微生物群落的转移、移动遗传元件(MGEs)和环境因素。全面了解ARGs的命运与预处理技术之间的关系,有助于系统评价各种预处理技术,促进新兴有效的预处理技术的发展。此外,考虑到预处理的有效性、经济效率和环境安全性,我们呼吁应用宏基因组和机器学习等现代分析方法来优化预处理条件并揭示潜在机制。

highlight

• 综述了不同预处理对甲烷产率和ARGs脱除效果的影响。

• ARGs可以被几次预处理去除,但在随后的AD过程中反弹。

• 通过预处理去除ARGs取决于操作参数和污泥性质。

• FNA(Free nitrous acid)预处理是同时回收资源和去除ARGs最有希望的选择。

• 宏基因组和机器学习的应用将有利于未来的研究。

卑尔根港的海水是携带毒力基因的共轭多药耐药质粒的存储库

水生环境在临床相关抗生素耐药基因(ARGs)和病原体的传播中起着重要作用。关于在海洋环境中,特别是在挪威,临床相关的获得性耐药基因的流行情况的知识有限。本研究的目的是利用绿色荧光蛋白****(GFP)****标记的大肠杆菌菌株作为受体,通过外源质粒捕获,研究卑尔根港海水中自传抗性质粒的存在和特征。我们从处理的13个样品中的4个样品中获得了抗氨苄西林和头孢噻肟的转偶联物。利用Illumina MiSeq和Oxford Nanopore MinION平台对基于抗生素敏感性模式选择的9种转偶联物进行测序。在这些transconjugants中检测到10个不同的质粒(从35 kb到136 kb不等),属于不亲和组IncFII/IncFIB/Col156、IncFII、IncI1和IncB/O/K/Z。质粒p1A1 (IncFII/IncFIB/Col156, 135.7 kb)携带耐药基因blaTEM-1dfrA17、sul1、sul2、tet(A)、mph(A)、aadA5、aph(3″)-Ibaph(6)-Id,对6类不同的抗生素具有耐药性。质粒p1A4携带blaCTX-M-55、lnu(F)、aadA17aac(3)-IId。头孢菌素酶blaCMY-2在质粒上被检测到,质粒是从当地海洋水族馆废水影响的区域捕获的。除ARGs外,一些质粒还携带毒力因子,如肠毒素、粘附因子和铁载体。我们的研究表明,卑尔根港海水中存在临床重要的多药耐药缀合质粒,这些质粒有可能转移到人类微生物群中。研究结果强调,需要按照世界卫生组织的建议,对环境中的抗生素耐药性进行监测,特别是在挪威等低流行率的国家。

highlight

• 捕获了10个不同的共轭多药耐药质粒(大小:35-136 kb)。

• 质粒属于IncFII、IncI1和IncB/O/K/Z不相容组。

• 来自海水的质粒还携带senBartA等毒力因子。

• 携带CTX-M-55的接合质粒属于IncI1-I(α)族。

• 所有质粒都能在肠杆菌科中繁殖。

conjugation assay

GFP标记的E.coli作为受体,海水中的微生物作为供体。二者分别再MH broth中过夜培养、离心重悬,调节OD600到0.6供试。

1mL的供体和受体菌液混合,过0.22μm滤膜,滤膜上的菌体于MH平板涂布,30摄氏度培养4小时。将平板上接合体加入PBS缓冲液中,再加入玻璃珠打破结合状态,随后稀释涂布,过夜培养。

plasmids annotation

在国家生物技术信息中心(NCBI)使用原核基因组注释管道(PGAP) v.4.13对质粒进行注释。使用CGView获得质粒的概况。使用PlasmidFinder 2.0对质粒复制子进行分型。使用ResFinder 4.1检查arg的存在和综合抗生素耐药性数据库(CARD)。使用毒力因子数据库(VFDB)中的VFanalyzer分析毒力基因。通过检索注释质粒的GenBank文件,检测生物杀菌剂/金属抗性基因(BMRGs)和偶联转移基因。

metagenome

肠道宏基因组具有中重度哮喘的代谢和抗生素耐药性特征

哮喘是一种常见的过敏性气道疾病,在生命早期与人类微生物组有关。婴儿肠道菌群的组成和功能都与哮喘风险有关,但老年哮喘患者肠道菌群的功能改变仍然是一个重要的知识鸿沟。在这里,我们对59名健康患者和36名中度至重度哮喘患者的95份粪便样本进行了全宏基因组鸟枪测序,以表征6岁及以上儿童和成人肠道微生物群的宏基因组。同源功能的图谱显示,即使考虑到其他重要的临床人口统计学因素,哮喘对宏基因组含量变异的贡献率也达到2.9%。差异丰度分析显示,长链脂肪酸(LCFA)代谢途径富集,这在哮喘患者的气道平滑肌和免疫反应中已被发现。我们还观察到哮喘患者中抗生素抗性基因(ARGs)的丰富度增加。一个差异丰富的ARG是大环内酯类耐药标记物ermF,它与脆弱拟杆菌毒素显著共存,表明肠毒素脆弱拟杆菌、抗生素耐药和哮喘之间可能存在关系。最后,我们发现在两个队列中同时出现的多种毒力因子(VF)和ARG对表明,在哮喘患者的粪便微生物群中,毒力和抗生素耐药性特征是共同选择和保持的。总的来说,我们的研究结果显示,通过LCFA生物合成基因的功能改变,以及中至重度哮喘患者肠道微生物群中抗生素抗性基因的增加,可能对哮喘的管理和治疗产生影响。

read-based metagenome profiling

为了获得关于粪便样本宏基因组含量的功能信息,使用HUMAnN v3.0.0对默认参数的过滤reads进行处理。HUMAnN用于鉴定分类身份的标记基因数据库为ChocoPhlAn v201901b,用于鉴定功能的蛋白质数据库为UniRef90完整数据库v201901b。对95个样本中至少16个样本中存在的Uniref90基因进行Alpha多样性分析和KEGG直系同源基因的双样本检验,这是允许Bonferroni校正的Wilcoxon p值低于0.0001的最低临界值。通过将UniRef90基因映射到MetaCyc数据库,HUMAnN用于确定宏基因组通路的丰度。我们使用Wilcoxon双样本检验对出现率至少为10%的通路进行了差异丰度分析。

为了鉴定MARS粪便宏基因组中存在的抗生素耐药性基因,使用ShortBRED-identify (v0.9.4)与综合抗生素耐药性数据库CARD和毒力因子数据库VFs。ShortBRED-Quantify使用默认参数在过滤后的读取上运行。在95个样本中,丰度大于0的arg或vf在不到7个样本中被排除在下游分析之外。这一临界值是使用二项分布确定的,以保持95%的置信度,即富集不是由于随机机会(使用stats::binom in R)。在比较毒力因子谱和抗生素耐药性基因谱的分析中,任何具有相同名称的基因都被排除在抗生素耐药性列表之外,只被视为毒力因子,以防止由于相互关联而产生虚假结果。只有一个基因符合这一标准:ugd (UDP -葡萄糖6-脱氢酶)。

微生物组成用HUMAnN管道中包含的MetaPhlAn 3.0进行测定。R中使用MaasLin(Maaslin2_1.5.1),将哮喘设为固定效应,将年龄组和种族设为随机效应,寻找与哮喘相关的任何分类级别的类群。

系统性红斑狼疮患者肠道病毒群的改变

在大量宏基因组数据集中,SLE(Systemic lupus erythematosus)患者的肠道病毒多样性显著降低,但在VLP(virus-like particle)宏基因组数据集中,这种变化不显著。此外,与健康对照组相比,在SLE患者中观察到整体肠道病毒组成的显著改变和病毒家族组成的显著变化,这两种技术都观察到。我们鉴定了408个vOTUs(177个sles富集和231个对照组富集),在主体病毒体中患者和对照组之间具有显著的相对丰度差异,在VLP病毒体中鉴定了18个vOTUs(1个对照组富集中有17个sles富集)。富含sles的vOTUs包括许多虹吸病毒科、微病毒科和粗类病毒,并经常被预测感染拟杆菌科、副杆菌科和瘤胃球菌_E,而富含对照组的vOTUs包含大量虹吸病毒科和肌病毒科成员,并被预测感染普雷沃氏菌和Lachnospirales_CAG-274。我们探索了肠道病毒和细菌之间的相关性,发现一些Lachnospirales_CAG-274和Hungatella_A噬菌体可能在病毒-细菌网络中发挥关键作用。此外,我们探索了用于疾病识别的肠道病毒特征,并实现了接受者操作特征曲线(AUC)下的面积大于0.95,这表明肠道病毒在预测SLE中的潜力。以上结果证实了SLE患者肠道病毒群的病毒多样性和分类组成的改变。对SLE病因学和肠道病毒群落的进一步研究将为治疗和预防SLE和其他自身免疫性疾病开辟新的途径。

Identification and clustering of viral sequences

High-quality clean reads for each bulk or virome metagenomic sample were performed for de novo assembly via MEGAHIT (25) with a broad range of k-mer sizes (–k-list 21,41,61,81,101,121,141). For bulk metagenome samples, all assembled contigs with a length ≥2 kbp were firstly assessed by using CheckV (26), and the non-viral contigs were removed if their viral gene count was less than the number of microbial genes. Then, we identified potential viral sequences from the remaining contigs based on two criteria: 1) contigs with P-value <0.01 and score >0.90 in DeepVirFinder (27); and 2) contigs identified as viruses by VIBRANT (28) with default options (-meta mode). Low-quality or “not-determined” viral contigs assessed by CheckV were further removed to avoid contamination. For virome metagenome samples, we identified potential viral sequences from the assembled contigs with length ≥2 kbp based on the following criteria: 1) contig whose viral gene was more than the number of microbial genes in CheckV (26); 2) contig with P-value <0.01 and score >0.90 in DeepVirFinder (27); and 3) contig identified as a virus by VIBRANT (28) with default options (-virome mode). According to the previous study (29), we searched for bacterial universal single-copy orthologs (BUSCO) (30) within viral sequences using hmmsearch (31) with the default options and calculated the ratio of the number of BUSCO to the total number of genes in each viral sequence (referred to as the BUSCO ratio). After removing highly contaminated viral sequences with a ≥5% BUSCO ratio, the remaining viral sequences were considered the final viral sequences for each sample.

The viral sequences were de-replicated using the following procedures: 1) all viral sequences were aligned pairwise using BLASTN with the options ‘-evalue 1e-10 -word size 20 -num alignments 99999’; 2) viral sequences that shared 95% nucleotide identity across 75% of the sequence were clustered into a viral operational taxonomic unit (vOTU) using in-house scripts.

Taxonomy assignment and host prediction of viruses

Viral protein-coding genes were called from the viral sequences using Prodigal (32). Taxonomic annotation of viral sequences was carried out based on protein sequence alignment to the combined database derived from the Virus-Host DB (downloaded in May 2021) (33), crAss-like protein sequences from Guerin’s study (34), and viral protein sequences from Benler’s study (35). To implement accurate family-level taxonomy, we first aligned proteins of viral sequences from NCBI RefSeq against the combined database using DIAMOND (36) with the parameters ‘–query-cover 50 –subject-cover 50 –id 30 –min-score 50 –max-target-seqs 10’. A viral sequence was annotated to the viral family level when over a quarter of its proteins were matched to the same family.

The virus-host prediction was performed using two bioinformatic methods that included prophage prediction and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-spacer matches. For prophage prediction, the viral sequence was blasted against the gut prokaryotic genes from the comprehensive unified human gastrointestinal genome (UHGG) database (37), and a host was assigned if the viral sequence matched the host genome at 90% nucleotide identity and 30% viral coverage (29). For CRISPR-spacer matches, we first predicted CRISPR spacer sequences from the UHGG genomes using MinCED (38) with the option ‘-minNR 2’, and then assigned a host to the virus if the host CRISPR spacer sequence was matched to the viral genome (bit-score ≥45) using BLASTN with options ‘-evalue 1e-5 -word_size 8 -num_alignments 99999’ (29).

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