Abstract
呼吸速率的测量值提供了一个重要的能量消耗和夜间植物细胞的线粒体活动读数。由于植物生长在不断变化的环境中，调节机制必须保证呼吸代谢迅速有效地适应细胞的代谢和环境条件。利用高通量方法，我们直接鉴定了特定的代谢物，这些代谢物对拟南芥成熟叶片的夜间耗氧量(RN)进行转录、翻译和翻译后的调控。多个小时的RN测量，叶片暴露在初级碳代谢物的组合(碳水化合物、氨基酸和有机酸)，鉴定到磷烯醇丙酮酸(PEP)、脯氨酸(Pro)和丙氨酸(Ala)是植物叶片RN中最有效的兴奋剂。多个代谢物组合一同使用，我们发现了代谢物-代谢物的调节相互作用来控制RN。许多氨基酸，以及葡萄糖类似物，被发现可以有效地抑制Pro和Ala产生RN的刺激，但不能抑制PEP产生的刺激。如果抑制雷帕霉素(TOR)激酶信号途径，这些氨基酸对Pro-和Ala-刺激RN的抑制作用也就得到了减轻【其实是确定了TOR和氨基酸(除Pro、Ala)的上下游关系】。这些起抑制作用的氨基酸也被证明是TOR激酶的激活剂。这项工作为植物TOR信号通路的研究提供了直接证据，TOR通过参与氨基酸调节来影响植物夜晚呼吸能量代谢。
Results
The stimulation of RN by metabolites is time dependent
首先用各种各样的代谢物进行的筛选，结果发现，大多数的外源代谢物处理对RN并没有肉眼可见的影响，但几种特定的代谢物对RN的刺激展示出较强的时间依赖性(F1)。在2-4h孵育后，特别是PEP，Ala和Pro对RN有较大的刺激效应，导致了RN在14h后出现了数倍增加(与WT相比)，近似两倍增加(与0h相比)。
Accumulation patterns of metabolites in leaf discs following exogenous exposure
我们不知道外源代谢物是否会被植物叶片吸收。因此，我们在4h孵育后，使用GC-MS检测了叶片中外源代谢物的积累量。除了Asp和Glu外，所有的氨基酸和糖酵解中间物都有大量的积累。
Stimulation of respiration by Pro and Ala is disrupted by the presence of other metabolites
图解：将空白处理设为0，只加Ala,Pro,Pep处理设为100。星号表示代谢物组合处理与单独的Ala,Pro,Pep处理有显著差异，ns为与添加共代谢物相比，再添加Ala,Pro,Pep并没有造成显著差异。
为了观察代谢物之间的相互作用是否会影响RN，我们将重点放在PEP、Pro和Ala引起的大的RN刺激是否会同时受到其它代谢物(称为共代谢物)的影响。通过对比这些孵育物14h的相对RN值，我们发现一些氨基酸(F2)和一些苹果酸(F3A-C)能够阻断Pro和Ala对RN的刺激。碳水化合物和糖酵解的中间产物并不会影响Pro、Ala和PEP对RN的刺激(F3D-F)。
三种葡萄糖类似物，氨基葡萄糖，2-脱氧葡萄糖和甘露糖，能抑制己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(参与磷酸戊糖途径)的活性。这三种共代谢物不能作为呼吸底物，从而能抑制RN，极大地抑制ALa和Pro对RN的激活，但在PEP刺激的RN的抑制上并不那么有效(F3D-F)。
PEP, Pro and Ala accumulation in leaf tissue accompanies respiratory stimulation
外源性Pro的滴定揭示了，更高浓度的外源性Pro引起更大的RN刺激(F4A)。而外源滴定Ala在浓度为5-10mM的时候展示出呼吸刺激峰值，而在高浓度下峰值下降(F4A)。外源施加Pro或Ala，不管多大浓度，都会增加叶片相应的积累量(F4B)。
接下来我们想看 破坏Pro和Ala对RN激活的共代谢物是否会阻碍叶片对Pro/Ala的吸收。结果发现，4h孵育处理后，与单独处理Pro相比，Ile和Met的存在减少了部分Pro的积累，而Met导致了Ala的减少(F4c)。
Ala and Pro stimulation of respiration occurs via changes in gene expression
接下来就检查基因表达水平。环己酰亚胺，抑制胞质核糖体的翻译，完全阻止了Pro和Ala对RN的刺激，但却并不影响叶片对其的吸收。这说明Pro和Ala对RN的动态增加与基因表达的改变息息相关。
为了查明是否Pro对RN的影响是由于脯氨酸脱氢酶(PDH)的作用(PDH在线粒体氧化Pro)，我们开始测试脯氨酸脱氢酶(PDH)的抑制剂-T4C是否能够减少Pro对RN的刺激。5mM的T4C在14h时减少了55%的Pro效应(F5A)。接着检查PDH的转录本，PDH1 and PDH2，发现使用Pro处理后，表达水平会增加，且PDH1的表达水平更高，早先有人认为PDH1行使了大部分PDH的功能(F5BC)。在突变体发现，pdh1-1展示出Pro刺激的RN减少(F5D)，而pdh2-1展示出与WT相似的RN值(F5E)。pdh1-1 pdh2-1双突中展示出了明显的RN值减少(F5F)。这些数据说明，外源的Pro在叶片积累诱导了PDH的表达，然后增加了线粒体内Pro的代谢，因此增加了RN。
与Pro类似，Ala处理诱导了丙氨酸：α-酮戊二醇氨基转移酶(AlaAT)的表达量增加，突变体里面极大减少了Ala诱导的RN增加。这些结果说明Ala刺激的RN涉及到线粒体内Ala到乙酰辅酶A的转变(F6)。
PDH expression is repressed by metabolites that also suppress Pro-stimulated RN
外源施加蔗糖能抑制PDH的表达，因此做阳性对照。在使用Pro处理下，氨基葡萄糖(Glc-N)完全阻止了PDH1的转录积累(F5G)。而PDH2与PDH1不同，蔗糖，苹果酸，Asp，Met，Ile显著抑制了PDH2在Pro存在下的积累(F5H)。而同样共代谢物对AlaAT1或AlaAT2的转录本丰度没有影响。
Metabolite-RN interactions are sensitive to TOR inhibitors
在动物和真菌中，氨基酸是TOR途径的强诱导剂，TOR途径主要控制营养感知和能量代谢。我们因此假设在氨基酸水平(非Pro、Ala)升高的情况下，植物通过TOR途径抑制氨基酸(如Pro、Ala)的呼吸分解。使用TOR抑制剂AZD进行处理，2uM的AZD对RN的效应依赖于哪种共代谢物的出现，在Asp和苹果酸出现时，AZD造成了强RN积累；在Met出现时造成较弱RN积累(仍有积累！F7a)。我们观察到在Ile和Met存在时，AZD部分恢复了Pro和Ala刺激RN的能力【早在Fig2就提出Ile或Met处理减少了Pro、Ala激活的RN增加，其实是确定Ile和Met与TOR的上下游关系】。两种其他的TOR抑制剂也展示了相似的结果(F7d,最后一列重点看)。
为了查明Ile的调节效应是否对Pro或Ala的呼吸分解代谢的作用是唯一的，还是对普遍的氨基酸代谢都起作用。我们因此选了Thr(刺激RN增加的效应仅次于Ala和Pro)，Thr刺激RN的效应被Ile抑制，这种抑制作用被AZD解除(F7E)。这些结果说明特定升高的氨基酸水平经由TOR路径来限制呼吸分解代谢。
使用WB来验证是否氨基酸可以激活TOR的磷酸化。早先证明蔗糖(图中suc)和葡萄糖(图中Gln)能够激活TOR。WB说明AZD完全抑制了TOR的磷酸化(F7f).
图示：星号表示在同一代谢物处理情况下，使用AZD具有显著差异；双匕首表示与没有Ala、Pro处理的相比，使用Ala、Pro具有显著的RN增加。
不管有没有Pro存在，AZD处理极大增加了PDH1和PDH2的表达,对ALAAT1和ALAAT2的增加的不大(F8A)。AZD缓解了一部分由共代谢物引起的PDH1、PDH2转录水平下降。(F8B)
为了进一步阐明TOR促分解代谢调节的机制，我们检测了是否存在AZD抑制TOR影响叶片对Pro的摄取。结果发现并未影响对Pro的摄取(F8C)。抑制TOR也激活了自噬。为了查明自噬是否对Pro和Ala激活的RN有影响，我们用了自噬抑制剂wortmanin，发现并没有太大影响(F8D)。因此，TOR信号与Pro诱导呼吸的相互作用似乎不需要改变Pro的摄取或自噬。
启示：
1.感觉这个model图以偏概全，氨基酸的地方应该改成Ile和Met，不懂为何要把Pro单独拿出来。
2.我们不仅可以做基因间的上下游关系，也可以做代谢物和基因的上下游关系。这种情况可能建立在该基因的功能较大。
3.要会点化学手段，过不了多久就是代谢的天下了。
