WGBS+Smart-seq2整合分析揭示抑制卵母细胞CpG高甲基化可保障胚胎正常发：Dev Cell

近日，瑞士巴塞尔大学/弗里德里希·米谢尔生物医学研究所Antoine H F M Peters团队在《Developmental Cell》期刊发表题为“Preventing CpG hypermethylation in oocytes safeguards mouse development”的研究成果，研究揭示了组蛋白去甲基化酶KDM2A（Lysine Demethylase 2A）和KDM2B在小鼠卵母细胞中的关键功能，及其通过抑制CpG岛（CpG islands, CGIs）的高甲基化以保障胚胎的正常发育机制。具体而言，母源缺失KDM2A/KDM2B导致卵母细胞出现全基因组范围的H3K36me2沉积，引发CGIs与基因体（genebody）的异常DNA甲基化，这种异常甲基化在受精后不能被早期胚胎完全重编程，最终通过抑制合子基因组激活（Zygotic Genome Activation, ZGA）导致植入前胚胎死亡。总之，研究通过整合全基因组甲基化测序（WGBS） 和单细胞转录组测序（Smart-seq2） 技术，首次阐明母源表观基因组稳定性对胚胎发育的跨代调控机制。

标题：Preventing CpG hypermethylation in oocytes safeguards mouse development（抑制卵母细胞中CpG高甲基化保障小鼠正常发育）

发表时间：2025年9月2日

发表期刊：Developmental Cell（Dev Cell）

技术平台：WGBS、Smart-seq2、CUT&RUN

作者单位：瑞士巴塞尔大学

DOI:10.1016/j.devcel.2025.08.005

除调控性CpG岛序列外，大多数哺乳动物细胞的基因组广泛存在DNA甲基化。然而在卵母细胞中，DNA甲基化（DNAme）主要发生在转录区域，抑制卵母细胞中de novo DNA甲基化的机制及其对合子基因组激活（ZGA）和胚胎发育的相关性尚不完全清楚。本研究揭示了两种组蛋白去甲基化酶KDM2A和KDM2B通过抑制H3K36me2的全基因组沉积，从而抑制DNMT3A催化的DNA甲基化。研究进一步发现，Kdm2a/Kdm2b双突变卵母细胞的CpG岛异常DNA甲基化会介导胚胎2细胞期的基因转录抑制。异常母源DNA甲基化会损害植入前胚胎发育，其通过在卵子发生过程中Dnmt3a缺失得以抑制，因此KDM2A/KDM2B对于抑制卵母细胞甲基化至关重要，进而赋予早期胚胎发育能力。本研究结果表明，早期胚胎的重编程能力不足以清除母源染色质上的异常DNA甲基化，且早期发育容易受到基因剂量单倍体不足效应影响，进而导致发育障碍。

KDM2A/KDM2B通过去甲基化H3K36me2以抑制小鼠卵母细胞中de novo DNA甲基化。

DNA序列和H3K4me3调控CGIs中的异常H3K36me2和DNA甲基化。

异常卵母细胞DNA甲基化在早期胚胎中不会被重编程，并抑制转录。

异常卵母细胞DNA甲基化的代际遗传对早期胚胎具有致死性。

研究摘要

研究方法

基因敲除小鼠模型的构建：通过Zp3-cre转基因小鼠，研究人员在卵母细胞中特异性敲除Kdm2a和Kdm2b基因，构建了Kdm2a/Kdm2b双敲除小鼠模型。

卵母细胞和胚胎的收集：从不同日龄的小鼠中收集生长期卵母细胞（GOs）和完全成熟卵母细胞（FGOs），并进行体外受精（IVF）以同步化受精时间。

单细胞转录组测序（Smart-seq2）：对单个卵母细胞和胚胎进行Smart-seq2测序，以分析基因表达变化。

全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）：对卵母细胞和胚胎4细胞期进行WGBS，以分析DNA甲基化状态。

染色质免疫沉淀（CUT&RUN）：对卵母细胞进行CUT&RUN实验，以分析组蛋白修饰状态。

免疫荧光染色：对卵母细胞和胚胎进行免疫荧光染色，以检测特定组蛋白修饰和DNA甲基化的分布。

甲基化-转录组关联分析：WGBS与Smart-seq2整合，鉴定因启动子高甲基化被抑制的ZGA基因。

结果图形

（1）卵母细胞中的Kdm2a/Kdm2b具有调控胚胎发育功能

Kdm2a和Kdm2b在卵母细胞中高表达，且在早期胚胎发育中发挥重要作用。Kdm2a/Kdm2b双敲除（double-mutant, dKO）的卵母细胞在发育过程中表现出严重的胚胎发育障碍，尤其是在囊胚阶段。表明KDM2A和KDM2B在卵母细胞中具有抑制DNA甲基化和保障胚胎正常发育的关键作用。

图1：KDM2A和KDM2B在卵母细胞中调控胚胎发育 (A) 对照（ctrl）和突变条件下卵母细胞中表达的Kdm2a和Kdm2b基因示意图。 (B) 对照、单突变和双/复合突变的体外胚胎发育的早期胚胎在指定天数的发育进展率。 (C–E) 对GOs（KDM2A）或FGOs（其他）的指定基因型进行KDM2A、细胞质KDM2B、H2AK119u1和H3K27me3的免疫荧光染色及定量分析。

（2）KDM2A/KDM2B调控PRC1介导的基因抑制

通过组蛋白修饰CUT&RUN分析发现，双敲除卵母细胞的H2AK119单泛素化（H2AK119u1）和H3K27三甲基化（H3K27me3）水平显著下降（图1D-E）。RNA-seq显示PRC1靶基因（如转录因子Pax、Tbx家族）在dKO卵母细胞中被激活（图2A）。这些基因在野生型中被H2AK119u1标记，而在突变体中解除抑制，表明KDM2A/B通过维持PRC1活性实现表观沉默。

图2. KDM2A/KDM2B在卵母细胞发生过程中调控H2AK119u1沉积和基因表达 (A) MA图显示指定突变FGOs相对于对照FGOs的差异表达。 (B) 维恩图显示指定突变FGOs相对于对照FGOs上调基因的数量。 (C) 散点图显示指定突变FGOs相对于对照FGOs的表达log2FC及之间的关系。 (D) 热图显示CGI启动子基因（上下游±5kb、TSS、基因体、TES）的序列组成、转录和染色质变量，通过k-means聚类将这些基因分为8个clusters（簇）。从左到右：每个cluster的基因数量；CpG覆盖率；GC百分比；卵母细胞特异性正义（绿色）和反义（红色）转录本；对照和突变FGOs中的绝对RNA；突变FGOs相对于对照FGOs的log2FC表达（delta）；对照和突变FGOs中的H2AK119u1占据情况；以及WT GOs和FGOs中的H3K4me3、H3K36me3、H3K27me3和H2AK119u1占据情况。 (E) 箱形图（Boxplot）显示对照FGOs中每个基因聚类的RNA表达水平。 (F) 箱形图显示在各种突变FGOs中相对于相应对照FGOs检测的每个基因聚类的log2FC表达变化。

（3）KDM2A/KDM2B招募抑制性PRC1到染色质上

基因聚类分析揭示PRC1靶标（Cluster 1-3基因）在双敲除（dKO）中显著去抑制（图2C）。KDM2B的CxxC结构域缺失导致其无法结合CGIs，致PRC1无法定位于染色质，证实二者通过物理互作招募抑制性复合体——变异型PRC1.1（vPRC1.1）。

（4）KDM2A/KDM2B限制基因上的H3K36me2沉积和DNA甲基化

KDM2A和KDM2B通过其JmjC结构域去甲基化H3K36me2，从而限制DNMT3A在基因中的DNA甲基化。在Kdm2a/Kdm2b双敲除（dKO）的卵母细胞中，H3K36me2和DNA甲基化水平显著增加（图3A），WGBS显示基因组平均CpG甲基化率从正常35.8%增加至58.8%（图3B），Hox基因等发育基因出现基因体异常甲基化（图3E）。表明KDM2A和KDM2B在限制DNA甲基化中发挥关键作用。关键验证：敲除Dnmt3a可完全挽救双突胚胎致死（图6B），证明DNA甲基化是致死主因。

图3. KDM2A/KDM2B限制卵母细胞中H3K36me2和DNA甲基化在启动子和基因上的沉积 (A) 对指定突变和相应对照基因型的GOs进行H3K36me2和H3K36me3的免疫荧光染色和定量分析，以及对FGOs进行5mC的免疫荧光染色分析。 (B) 2D密度图显示突变FGOs与对照FGOs中CpGs的平均甲基化水平（mCpG/CpG百分比）分布。 (C) 小提琴图展示指定基因型FGOs中不同基因组元件的mCpG/CpG（%）值的分布。 (D) 热图显示之前在图2D中描述的8个CGI启动子基因聚类的序列组成和染色质变量。从左到右依次为：CpG覆盖率；GC百分比；指定基因型FGOs中的H3K36me2、H3K36me3和DNA甲基化；突变FGOs与对照FGOs中CGI启动子的差异DNA甲基化。 (E) Hoxa-Evx1基因聚类的基因组快照，展示突变FGOs与对照FGOs相比，CGI启动子（橙色）和基因体中DNA甲基化和H3K36me2的增加情况。 (F) 箱形图展示在Kdm2aKOKdm2bKO FGOs与对照FGOs相比，被分配到表达上调、下调、未改变或未检测到的基因聚类CGI启动子(-1,500/+500 bps的TSS)或基因体(+500bps的TSS到TES)的差异H3K36me2、DNA甲基化和H3K36me3。 (G) 箱形图展示在Kdm2aKOKdm2bKO和Kdm2aKOKdm2bΔCxxC FGOs与对照FGOs相比，8个CGI启动子基因聚类的所有基因启动子上的差异H3K36me2和DNA甲基化。

（5）KDM2A/KDM2B调控在CGI启动子上的H3K36me2沉积和DNA甲基化

在Kdm2a/Kdm2b双敲除的卵母细胞中，CGI启动子上的H3K36me2和DNA甲基化水平显著增加（图3D），CGI高甲基化与H3K36me2沉积同步发生（图3F）。表明KDM2A/KDM2B在限制CGI启动子上的DNA甲基化中发挥关键作用。

（6）KDM2A/KDM2B在全基因组范围内抑制H3K36me2沉积和DNA甲基化

基于H3K4me3、H3K36me3、H3K27me3和H2AK119u1在WT FGOs中的占据情况，分析了突变FGOs与对照FGOs中H3K36me2、H3K36me3和DNA甲基化水平的变化（图4A）。分析结果表明，KDM2A/KDM2B蛋白在卵母细胞发育过程中维持低水平H3K36me2的作用不仅限于CGI，还具有显著的全基因组效应（图4B-4D）。在卵母细胞生长过程中，H3K36me2广泛沉积与转录无关，且这种沉积能被KDM2A/KDM2B蛋白有效抑制。

图4：在Kdm2a/Kdm2b缺失的卵母细胞中，H3K36me2和DNA甲基化的沉积与转录无关 (A) 热图展示卵母细胞中10kb基因间区的8个clusters内的染色质和转录变量。数据以20个相邻的500bp bins显示。从左到右依次为：每个cluster的区域数量；CpG覆盖率；GC百分比；对照和突变FGOs中的H2AK119u1、H3K36me2和DNA甲基化；在20kb侧翼区域内存在注释的TTS；在第9天和第14天的GOs中，指定突变和对照基因型之间的表达log2FC；在随机引物（总）第14天的GOs和FGOs中。RNA表达数据基于poly(A)引物RNA捕获和Smart-seq2文库生成。 (B–D) 基因组区间15,42,43的快照展示在对照FGOs中标记有H2AK119u1和H3K27me3的大基因间区域，在Kdm2aKOKdm2bKO FGOs中H3K36me2和DNA甲基化的增加。

（7）生长期卵母细胞（GOs）中的H3K4me3抑制异常DNA甲基化

机制回归模型证明低H3K4me3是GOs中异常甲基化的主要"许可因子"（图5A）。该机制独立于PRC1通路——即使非PRC1靶基因启动子（如代谢基因Gldc），只要H3K4me3缺失即易受甲基化侵袭。

图5：GOs中低水平的H3K4me3允许在卵母细胞生长期间获得H3K36me2和DNA甲基化 (A) 散点图显示在对照和野生(WT)型FGOs中，启动子和基因内CGI的H3K36me2和H3K4me3占据与DNA甲基化（%）之间的相关性。 (B) 散点图显示在Kdm2aKOKdm2bKO与对照FGOs之间，启动子和基因内CGI的差异DNA甲基化（%）与Kdm2aKOKdm2bKO FGOs中H3K36me2的占据以及野生型GOs中H3K4me3的占据之间的关系。 (C) 条形图显示可预测Kdm2aKOKdm2bKO与对照FGOs中CGIs处差异H3K36me2占据的染色质标记、基因组位置和三核苷酸序列的线性回归系数。 (D) 箱形图表示在GOs中具有低或高H2AK119u1水平的H3K4me3占据区域，CGI中心周围533bp区域每100bp的CCG/CGG三核苷酸频率以及在对照和Kdm2aKOKdm2bKO FGOs中H3K36me2的富集。 (E) Cartoon图说明DNA序列、组蛋白修饰酶和DNA甲基转移酶在调节H3K36二/三甲基化和de novo DNA甲基化之间的依赖关系。

（8）组合序列和染色质特征定义CGI的异常H3K36me2沉积

CGI上的异常H3K36me2沉积与H2AK119u1和H3K27me3的水平相关，且受到H3K4me3的抑制。在Kdm2a/Kdm2b双敲除的卵母细胞中，CGI上的H3K36me2水平显著增加，且与H3K4me3水平较低的CGI启动子相关（图5C），表明组合序列和染色质特征在定义CGI上的异常H3K36me2沉积中发挥关键作用。

（9）异常母源DNA甲基化损害植入前发育

作者研究了Kdm2a/Kdm2b突变卵母细胞中增加的DNA甲基化对胚胎发育的影响。研究发现，这些突变导致的异常甲基化在受精后并未被重编程，影响了胚胎的早期发育。通过条件性突变Dnmt3a功能，作者发现母源Dnmt3a缺失可以完全抑制由Kdm2a/Kdm2b突变引起的胚胎致死，而DNMT1酶缺失则没有这种效果。这表明KDM2A和KDM2B在卵母细胞中的一个重要功能是通过抑制H3K36me2沉积以抑制DNMT3A功能和de novo DNA甲基化。

图6. 异常母源DNA甲基化损害植入前发育 (A) 对照和突变晚期合子的母源（m）和父源（p）原核进行5mC的免疫荧光染色和定量分析。 (B) 对照和三重突变的植入前胚胎在体外胚胎发育指定天数的发育进展。 (C) 汇总表总结具有指定基因型的胚胎的植入后发育情况。 (D) MA图显示母源突变与相应对照胚胎2细胞期相比的差异表达。 (E) 左侧：散点图显示Kdm2amatKOKdm2bmatKO与对照胚胎2细胞期相比的log2FC表达量及Kdm2aKOKdm2bKO与对照FGOs log2FC表达量之间的关系，靶向CGI和非CGI启动子相关基因的亲本特异性表达。右侧：与左侧相同的数据，但靶向Kdm2amatKOKdm2bmatΔCxxC 与对照胚胎2细胞期相比以及Kdm2aKOKdm2bΔCxxC与对照FGOs的比较。Kdm2aKOKdm2bKO与对照FGOs相比的启动子差异甲基化（%）用颜色区分。

（10）母源Kdm2a/Kdm2b双敲除会损害植入后发育

在Kdm2a/Kdm2b双敲除的卵母细胞中，异常DNA甲基化在植入后发育中得以维持，并损害胚胎发育。在Kdm2a/Kdm2b双敲除的e9.5胚胎中，发育迟缓的胚胎数量显著增加（图6C），此阶段致死与Dnmt3a缺失致死表型分离，提示KDM2A/B另有非甲基化相关功能。

（11）异常DNA甲基化抑制卵母细胞中的基因表达

为评估母源Kdm2a/Kdm2b缺失对胚胎基因调控的影响，研究人员对JF1/Ms雄性小鼠与Kdm2amatKOKdm2bmatKO 雌性小鼠的胚胎2细胞期进行差异表达分析。结果显示数百个基因表达失调，且存在明显的等位基因特异性反应。母源等位基因在卵母细胞和胚胎2细胞期中的差异表达呈正相关，而父源等位基因则无此关联。值得注意的是，双突变胚胎2细胞期中36%表达下调的母源CGI启动子基因，在Kdm2aKOKdm2bKO卵母细胞启动子区呈现高甲基化（>50%）。但矛盾的是，部分甲基化CGI基因在突变卵母细胞中表达上调。在Kdm2amatKOKdm2bmatΔCxxC和单突变Kdm2bmatΔCxxC样本中也观察到类似的转录和甲基化反应。

为深入探究异常DNA甲基化与转录组间的机制关系，研究人员根据ctrl、三突变卵母细胞和野生型精子中CGI启动子的DNA甲基化状态，将其分为7个clusters。cluster1-4中近1500个CGI启动子在突变卵母细胞中出现广泛异常甲基化；cluster 5中超1250个CGI启动子在Kdm2aKOKdm2bKO卵母细胞中呈现中度异常甲基化。GO分析表明，cluster 1-5的许多基因在发育中起重要作用，且多为PRC1靶基因。cluster 6的CGI在对照和突变卵母细胞中均高甲基化，可能位于卵母细胞特异性上游启动子转录的基因体内。cluster 7的CGI在任何基因型中基本未甲基化或低甲基化。成熟精子中无明显CGI甲基化。

进一步分析异常CGI启动子DNA甲基化与基因表达变化的关系。在卵母细胞中，上调和下调基因在各cluster分布较均匀，但cluster 2-4中表达下调的基因与异常DNA甲基化显著相关，可能是异常DNA甲基化直接抑制了CGI启动子。而cluster 2-5中其他UCSC注释的CGI异常甲基化与双突变卵母细胞中表达上调的基因相关，但在突变胚胎中无此现象。cluster 6的CGI甲基化增加可能与转录偶联过程有关，这些CGI位于通常受PRC1抑制的卵母细胞特异性上游启动子转录的基因组区域内，其异常转录本在CGI上下游均升高。研究揭示了母源Kdm2a/Kdm2b缺失通过影响CGI启动子DNA甲基化状态，进而调控基因表达。

图7：被异常母源启动子DNA甲基化标记的基因在早期胚胎中受到抑制 (A) 热图显示根据UCSC数据库的CGI启动子在对照和突变FGOs以及WT精子中的绝对启动子甲基化水平进行聚类结果。 (B) 与(A)中DNA甲基化clusters1-5相关的CGI基因的富集程度和统计显著性水平GO富集分析。 (C) 在Kdm2aKOKdm2bKO与对照FGOs以及在Kdm2amatKOKdm2bmatKO 与对照胚胎2细胞期中，CGI启动子基因和所有非CGI启动子基因的log2FC表达。 (D) 条形图显示在DNA甲基化clusters中，CGI启动子基因的过/低表达情况以及它们在Kdm2aKOKdm2bKO与对照FGOs或在Kdm2amatKOKdm2bmatKO 与对照胚胎2细胞期中的显著上调或下调表达的统计显著性。 (E) 条形图显示在用RNA聚合酶II和III的抑制剂α-鹅膏蕈碱处理的胚胎2细胞期中，显著上调或下调的DNA甲基化clusters中的CGI启动子基因的过/低表达情况和统计显著性。 (F) 热图显示了根据UCSC数据库的CGI启动子在对照和Kdm2aKOKdm2bKO FGOs以及对照和Kdm2amatKOKdm2bmatKO 胚胎4细胞期中母源和父源基因组的绝对启动子DNA甲基化水平进行聚类。Mat-和pat-hypo指的是在对照胚胎中发生de novo甲基化的CGI。 (G) 在Kdm2amatKOKdm2bmatKO 与对照胚胎2细胞期中，根据亲本特异性测序读数，(F)中所示的不同CGI和非CGI启动子基因簇的log2FC表达。 (H) 根据亲本特异性测序读数，在Kdm2amatKOKdm2bmatKO 与对照胚胎2细胞期中，根据(F)定义的DNA甲基化clusters中的CGI启动子基因的过/低表达情况及其显著上调或下调表达的统计显著性。 (I) Gldc、Eomes和Hes2基因的基因组快照显示在卵母细胞和胚胎4细胞期中CGI启动子（橙色）的异常DNA甲基化。

（12）异常DNA甲基化与胚胎2细胞期的母源基因抑制相关

在Kdm2a/Kdm2b双敲除的胚胎2细胞期胎中，异常DNA甲基化与母源基因抑制相关。通过杂交品系（C57/JF1）等位分析显示，dKO来源的胚胎2细胞期中，高甲基化基因的母源拷贝特异性沉默。父源拷贝表达正常，提示"基因剂量不足"是致死机制。

（13）母源异常DNA甲基化在胚胎4细胞期中得以维持

在Kdm2a/Kdm2b双敲除的胚胎4细胞期中，异常DNA甲基化得以维持。卵母细胞甲基化在胚胎4细胞期未按预期"稀释"（图7F）。333/479高甲基化CGI维持>75%甲基化水平，远超复制稀释效应（理论应降至25%-50%），证明主动维持机制介入。

（14）高甲基化影响关键发育调节基因启动子

在Kdm2a/Kdm2b双敲除的卵母细胞中，许多关键发育调节基因的启动子发生高甲基化。GO分析显示高甲基化基因富集在发育关键通路：Bmp4、Wnt2基因介导；Sox17、Gata4基因介导细胞命运决定，Gldc介导代谢调控，其中Hes2等基因同时受甲基化抑制，其功能缺失直接导致胚胎停滞。

结论和启示

本研究揭示了KDM2A和KDM2B在卵母细胞中的关键作用，强调了其在抑制DNA甲基化和维持胚胎正常发育中的重要性。KDM2A和KDM2B通过H3K36me2去甲基化，抑制了DNMT3A在卵母细胞中建立全局DNA甲基化的能力。此外，KDM2A和KDM2B通过其CxxC结构域招募PRC1复合体到CGI启动子上，从而抑制基因表达。这些发现不仅加强了对卵母细胞基因组甲基化调控机制的理解，还为研究胚胎发育过程中的表观遗传调控提供了新视角。此外，该研究应用WGBS和Smart-seq2技术在解析基因组甲基化和基因表达调控，为未来类似研究提供了关键技术参考。

参考文献：

Kawamura YK, Ozonov EA, Papasaikas P, Kondo T, Nguyen NV, StadlerMB, Smallwood SA, Koseki H, Peters AHFM. Preventing CpG hypermethylation inoocytes safeguards mouse development. Dev Cell. 2025 Aug 29. doi:10.1016/j.devcel.2025.08.005.