写在前面（19.11.14，11.19）
最近需要写一份博士研究计划，感觉最近单细胞RNA-seq（scRNA-seq）和单细胞ATAC-seq（scATAC-seq）联合分析很火，想着在硕士研究的基础上蹭一下热度，单细胞水平达不到，可以用bulk cells嘛。 但是，作为一个生信小白，怎么才能写出一篇看起来是那么回事的研究计划呢？ 之前在jimmy大神的生信技能树中看过很多关于ATAC-seq数据分析的文章，对理论知识和流程有所了解，但是就是处于光说不练瞎把式的状态，所以只能硬着头皮比着葫芦画瓢看看怎么写。 详细信息可以参见生信技能树的实操系列教程目录
ATAC-seq指南
意外的发现
在google一下的时候，突然发现了Harvard FAS的一篇文章 ATAC-seq Guidelines，感觉这篇文章讲的框架非常好，比较适合我这种急功近利对ATAC-seq做一个全面了解的人，因此我特地把我的一些收获写出来。不是单纯的翻译，只是记录一些学习过程。 ##ATAC-seq 概况 我的理解：基因在进行调控时，其上游染色质是属于开放的状态，探究这种开放的情况可以获得该状态下整体的基因调控情况。T5转座酶是可以插入到开放的区域并切割DNA片段，因此将T5转座酶连接上特异性的 adapters，再将片段收集测序，就能得到全基因度尺度上处于开放状态的染色质区域。详细知识参考ATAC-seq基础知识 文献：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4374986/
实验设计
一些注意事项：（太长不看版）
重复：一般两个足够。
对照：一般不用，可以使用不加转座酶，然后加上接头的片段化DNA。
PCR扩增：建库过程中少进行PCR扩增，可能会影响后续分析。
测序深度：取决于基因组大小和染色质开放程度，人类样本5千万reads。
测序模式：推荐双端测序。
线粒体：最好去除，方法见 Omni-ATAC method
一些注意事项：（婆婆妈妈版）
重复 重复可以确保你的样品产生的数据是由生物效应引起的，而不是某个特定样本的特性或其处理过程造成的。 （这里我想到一个问题，像我研究的真菌是含有细胞壁的，酶解是去除细胞壁而又不伤害细胞核的方法，可以方便后续提取细胞核，但是酶解对细胞会产生一定的影响，尤其是如果实验处理就是温度处理的话，估计影响会很大。）
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对照
我的理解就是，分析的时候就可以把没有处理的作为对照，似乎不太需要单独做一个纯阴性对照。
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PCR扩增
主要是关于PCR重复的问题，关于为什么会产生重复，重复会对后续分析产生哪些影响？
可以参考以下几篇文章，都很有趣，值得学习。
How PCR duplicates arise in next-generation sequencing、试论NGS数据的Duplication问题 关于二代测序中的duplication 、如何去除二代测序数据中的PCR duplication才科学？
我的理解就是建库加接头或者仪器读取过程中会产生PCR重复，而重复会对Peak calling产生影响，因此需要去除。
在 Genrich 中，-r 可以进行PCR重复的移除。
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测序深度：
暂时不知道咋写
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测序模式：
双端测序的优势：
1）有助于提高重复序列比对的准确性，参见 单端测序与双末端测序问题- 简书 ， [序列拼接] 双端测序，原理+ 拼接（Pandaseq） - 知乎
2）双端测序可以获得更多的关于转座酶插入位置的信息。
3）单端测序中只要5‘ 端一样就会被认定为duplication，会产生假阳性的结果，也有可能去除了不该去除的序列，而双端测序避免了这种情况。
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线粒体：
ATAC-seq 中含有很大一部分线粒体DNA，参见this discussion
而我们关注的只是核DNA，因此要对线粒体DNA进行去除，一般可以从实验方法和分析方法两个方面进行去除（同时进行）。
实验方法去除可参见：Omni-ATAC method 、ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes、 using CRISPR to reduce mitochondrial contamination
分析方法：Genrich中可以使用
-e chrM命令来去除线粒体的reads
总结
分析部分后续再写吧，还打算以一篇文章进行实战Chromatin Accessibility-Based Characterization of the Gene Regulatory Network Underlying Plasmodium falciparum Blood-Stage Development 另外，该指南还有一个旧版本，还没仔细看，目前新版本分析Peak-caliling中没有使用Macs2，而是用的Genrich，走Macs2流程的话请参见老版本。
