Immunity丨免疫治疗中TIGIT 和 PD-1 双重阻断的重要性

原创 珍奇 图灵基因 

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：珍奇

IF：31.75

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亮点：

本研究发现，CD226参与了抗PD-（L）1及抗TIGIT抗体治疗；肿瘤浸润性淋巴细胞会差异性表达CD226和CD28；PD-1和TIGIT通过不同的机制削弱了CD226的磷酸化；PD-1和TIGIT对CD226的共同抑制作用为双重阻断机制提供了解释。

T 细胞抑制受体（如 CTLA-4、PD-1 和 TIGIT）对于限制免疫病理学、终止免疫反应至关重要，但与此同时，它们也会抑制抗肿瘤免疫反应。针对这些抑制性受体的免疫治疗抗体，主要通过增强抗原特异性 T 细胞效应从而在癌症患者中发挥活性作用，但事实上仅有少数患者对此产生有效反应。因此，这些抗体之间以及与其他治疗剂的联合使用引发了肿瘤免疫学研究者们的兴趣。2022年3月8日，美国加利福尼亚大学Ira Mellman研究团队于《Immunity》杂志上发表了一篇名为“Mechanistic convergence of the TIGIT and PD-1 inhibitory pathways necessitates co-blockade to optimize anti-tumor CD8+ T cell responses”的文章。在本研究中，Banta等人发现PD-1和TIGIT通过不同的机制破坏了共刺激受体CD226的激活，为PD-（L）1和TIGIT在癌症免疫治疗中的双重阻断提供了机制理论依据。

在先前的研究中，已有结果表明CD226和CD28的共同刺激需要克服 PD-1 和 TIGIT 的抑制作用。为了更详细地了解这种关系，本文研究者监测了野生型 (WT) 及Cd226-/-小鼠中同源 CT26 肿瘤细胞的生长情况。结果如图1A所示，与使用对照抗体治疗的动物相比，接受抗 PD-1 或抗 TIGIT 的 WT 小鼠表现出肿瘤生长减少的趋势，而对于Cd226-/-小鼠的治疗效果显著降低甚至丧失。此外，图1B的结果也证实了PVR及PVRL2对CD226 信号的调节在介导 CD8+ T 细胞反应中的作用，这一作用不仅受 TIGIT 控制，还受 PD-1 控制。

图1. CD226 缺乏会降低 PD-1 和 TIGIT 检查点阻断的功效并损害 CD8+ T 细胞反应

紧接着，为了研究CD226的表达是否也是非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者使用阿替利珠单抗（atezolizumab，一种抗 PD-L1 单克隆抗体）后临床治疗反应的决定因素，他们分析了三项使用阿替利珠单抗后NSCLC 肿瘤样本的RNA-seq，并评估了CD226、PDCD1和 TIGIT 的基因表达与临床结果。每个试验中CD226、CD28、PDCD1 和 TIGIT 的表达范围很广，但 CD226 和 CD28 的表达与PDCD1和 TIGIT密切相关。根据肿瘤内 CD226 表达对每个临床试验中的患者进行分层，结果表明CD226表达与总生存期 (OS) 和改善的无进展生存期（PFS）之间存在关联。在这些试验中，肿瘤内 CD28 表达的升高与临床治疗效果的改善无关，PDCD1 或TIGIT 表达也与临床反应无相关性。总之，这些数据表明癌症中的抗 PD-L1 反应与CD226 表达相关，与CD28 表达无关。

图2. CD226 表达及其与 NSCLC 中对 PD-L1 检查点阻断治疗的临床反应的关联

随后，他们通过高维飞行时间质谱流式细胞术（CyTOF）分析了 NSCLC 患者样本中CD226、CD28、PD-1 和 TI-GIT 表达的分布；开发了一个参数组，用于识别免疫细胞谱系、组织驻留标志物、激活和抑制标志物以及转录和细胞毒性因子。根据 Ki67 的表达，所有细胞都表现出一定程度的增殖潜力，但 CD226+CD28+ 细胞表达高水平的CD27，这是抗原特异性扩增和记忆 T 细胞早期发育的标志物。与 T 细胞衰竭标志物TIM-3 相比，它们还表现出更高水平和频率的 PD-1 和 TIGIT 表达。尽管存在显着重叠，但 CD28 阳性的细胞群也表达了较低水平的 CD103，这是一种定义 Trm 细胞的标志物。

图3. CyTOF 对 NSCLC 肿瘤 CD8+ T 细胞中 CD226 和 CD28 表达的分析

为了获得 CD8+ T 细胞更详细的表型分析，他们对CD45+细胞进行了单细胞 RNA 测序(scRNA-seq)。基因表达分析通过无监督聚类将 CD8+ TIL 划分为 8 个簇，并使用原始、未缩放计数数据的分层聚类来可视化簇之间的差异基因表达。随后他们分析了每个CD8+ T 细胞簇中 CD28 或 CD226 的分布。结果如图4所示。

图4. 通过 scRNA-seq 分析NSCLC 肿瘤中 CD8+ T 细胞中的 CD226 和 CD28 表达

已知没有 PD-1 和 TIGIT 表达的 CD226+ Jurkat 细胞在负载 PD-L1+PVR+ SEE 的Raji 细胞刺激后 2 分钟内表现出 CD226 (pCD226) 的强磷酸化。Jurkat 细胞中 PD-1或 TIGIT 的表达降低了 pCD226，表明 PD-1 和 TIGIT 可以独立地抑制 CD226。然而，当 PD-1 和 TIGIT 都表达时，检测到的 pCD226更少，这表明 PD-1 和 TIGIT 共同作用以调节 CD226 的活化。向细胞中添加抗 PD-1 或抗 TIGIT 可部分恢复pCD226，同时提供抗 PD-1 和抗 TIGIT 进一步使 pCD226水平升高。

接下来，他们研究了 PD-1 在没有 TIGIT 的情况下调节 CD226 磷酸化的能力。先前的一项研究表明，脂质体重组的 PD-1:Shp2 复合物可以使 CD226 ICD 去磷酸化；然而，PD-1 调节完整 T 细胞中 CD226 磷酸化的程度尚不清楚。图5C结果表明，CD226+PD-1+ Jurkat 细胞在暴露于 PVR+PD-L1+ SEE 负载的 Raji 细胞后表现出一定水平的 pCD226。为响应 PD-1 阻断，pCD226 水平在 2 分钟和 10 分钟时间点均增加了 1.5 至 2.0 倍。这种效应依赖于 PVR 与 CD226 的结合，因为 CD226 阻断mAb 消除了这种效应。在任何测试条件下，他们都没有观察到 CD3z 磷酸化的系统性差异。这些数据表明，PD-L1 和 PD-1 信号通路抑制了 PVR 诱导的 CD226 磷酸化。此外，这种效应还需要 PD-1 的 ICD (PD-1ICD)，因为缺乏 ICD (PD-1DICD) 的 PD-1突变体的表达在刺激后未能减少 pCD226 的量。ICD 要求表明 PD-1 通过其细胞内效应物抑制 CD226 磷酸化，例如由 PD-1ICD 募集的 Shp2 磷酸酶。

接下来他们研究了 TIGIT 如何调节 CD226 信号。与 PD-1 类似，TIGIT 的 ICD (TIGTICD) 包含两个嵌在免疫球蛋白尾酪氨酸 (ITT) 基序和免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM) 中的酪氨酸。鉴于几种含 ITIM 的受体能够募集含 SH2 的磷酸酶，因此很容易假设 TIGIT 以类似的方式募集 Shp1 或 Shp2。然而，与 PD-1ICD 不同，TIGTICD 缺乏相关的基于免疫受体酪氨酸的开关基序 (ITSM)，这可能会限制效应子的募集。为了确定 TIGITCD 在调节 CD226 磷酸化中的作用，他们将 CD226 与 WT TIGIT (TIGITWT)、没有 ICD 的 TIGIT 突变体 (TIGITDICD) 或具有两种可磷酸化酪氨酸转变为苯丙氨酸的全长 TIGIT 突变体 (TIGITFF)共同于Jurkat 细胞中表达。在添加 PVR+ SEE 加载的 Raji 细胞后，pCD226 被 WT TIGIT 和 TIGIT 突变体抑制到相似程度。因此，与 PD-1 相比，TIGTICD 对 pCD226 的抑制作用是非必要的。总之，这些数据表明 PD-1 通过将 Shp2 募集到其 ICD 来抑制 CD226 磷酸化，而 TIGITICD 对pCD226 的抑制作用是非必要的，这可能是由于TIGIT ITIM 的低效磷酸化所致。

图5. PD-1和TIGIT通过不同的机制共同调节CD226。

他们接下来关注 TIGIT 的细胞外结构域 (ECD)，已知它与 CD226 竞争结合其共享配体PVR。首先，他们推断当配体受到限制时，配体竞争效应会更加明显。在 2 分钟和 5 分钟时间点，Jurkat 细胞中的 CD226 磷酸化程度高于 Raji 细胞的低 PVR 表达。尽管TIGIT 与 CD226 的共表达在 PVRhi 和 PVRlo 条件下均降低了 pCD226 信号，但在PVRlo 条件下 pCD226 的降低更为明显，这与配体竞争模型一致。与模型一致的是观察到 PVR 以剂量依赖性方式诱导 TIGIT 磷酸化。

为了表征 Raji:Jurkat 界面处PVR:CD226 和 PVR:TIGIT 的相互作用，他们对Raji:Jurkat 对联进行了共聚焦显微镜检查，以确定 PVR 诱导的 CD226 和 TIGIT 是否在细胞-细胞接触部位表现出极化。当 CD226+ Jurkat 细胞遇到 PVR+ Raji 细胞时，CD226 富集到 Raji:Jurkat 界面。这种富集被一种阻断 PVR:CD226 相互作用的抗CD226 mAb——DX11 消除。因此，CD226 的极化富集是由 trans-PVR:CD226 相互作用驱动的。这些发现表明， TIGIT 破坏 CD226 同二聚化的能力也可能不涉及 ICD 相互作用。为了测试这种可能性，他们用Flag-SNAP 标记 (ST) CD226 转染细胞。然后使用时间分辨 FRET (TR-FRET) 监测细胞表面上不同受体对之间的相互作用。与单独的Flag-ST-CD226 相比，Flag-ST-CD226 与 HA-TIGIT 结合产生了显着的 TR-FRET 信号。这些结果表明，TIGIT 和 CD226 通过其相应的 ECD 相互作用，并且 TMD 和 ICD都不是这种相互作用所必需的。

图6. TIGIT 通过 ECD 的横向关联抑制 CD226

教授介绍：

Ira Mellman，美国加利福尼亚大学医学院生物化学与生物物理学教授。其团队主要集中研究癌症免疫学和免疫治疗中免疫反应的细胞机制，试图了解检查点抑制剂（例如抗PD-L1）、疫苗、免疫激动剂及其组合如何能产生持久的抗癌反应。其中，基础研究是主要重点，目前包括各种项目有：（i）使用新的无细胞重组系统了解 T 细胞上的负调节剂（如 PD-1）如何限制 T 细胞反应; (ii) 了解树突状细胞如何交叉呈递肿瘤来源的抗原以启动抗癌 T 细胞反应； (iii) 探索靶向抗癌剂增强T 细胞免疫的能力； (iv) 预测人类癌症中的免疫原性 T 细胞表位； (v) 使用转基因细胞结合新的成像方法（如晶格光片显微镜）对肿瘤中的 T 细胞功能进行实时成像。

参考文献：

Banta, Karl L et al. “Mechanistic convergence of the TIGIT and PD-1inhibitory pathways necessitates co-blockade to optimize anti-tumor CD8+ T cellresponses.” Immunity vol. 55,3 (2022): 512-526.e9.doi:10.1016/j.immuni.2022.02.005