【文章标题】Aberrant R-loop–mediated immune evasion, cellular communication, and metabolic reprogramming affect cancer progression: a single-cell analysis
【发表杂志】Molecular Cancer（IF：37.3）
【发表时间】2024年1月
【关键词】R-loop, Tumor immune escape phenotype, Cell communication, Immunotherapy, FANCI, Non-small cell lung cancer
闪光点
全面分析了R-loop在肿瘤免疫微环境（TME）中的分布模式，强调了异常R-loop在癌症发展中的因果作用。
揭示了R-loop评分模式下代谢重编程和T细胞衰竭的潜在分子机制。
为低评分R-loop分布下免疫逃逸和代谢重编程介导的药物耐受机制提供了新的思路。
方法与结论
亮点解析
构建R-loop评分，说明R-loop与LUAD进展相关
文章整合了两个LUAD单细胞数据集（GSE123904和GSE131907），包括30个癌症样本：3个接受了新辅助化疗，17个样本显示为原发肿瘤，10个样本显示为远端转移肿瘤。其中，12个样本含有致癌驱动基因EGFR突变（图1左）。降维和注释后，最终得到10种已知的细胞类型。通过染色体拷贝数变异（CNV）分析，区分出恶性细胞和非恶性细胞群，发现患者间异质性主要由恶性细胞贡献（UMAP图中各样本上皮细胞没有很好的聚在一起，图1右）。
根据1,185个R-loop调节因子的表达数据进行WGCNA分析，筛选出与EGFR突变、组织起源和TNM分期相关的四个模块，来自四个模块的92个调节因子在DNA损伤/修复相关途径中显着富集，以此构建评分模型来表征R-loop状态。结果显示，低评分细胞在晚期肿瘤的恶性细胞组成中占主导地位，且KRAS和TP53突变患者的评分均显着较低（图2左）。与此同时，R-loop评分较低的恶性细胞显示出增强的增殖状态，细胞周期相关蛋白显着上调，表明这些细胞中的细胞周期激活（图2右）。这里文章说明了R-loop可能在肿瘤进展中发挥关键作用。
R-loop影响免疫逃逸，并重塑免疫微环境
低R-loop评分组下调肿瘤相关抗原（TAA）和主要组织相容性复合物（MHC）分子的表达，但上调恶性细胞中肿瘤相关免疫抑制因子。使用单样本基因集富集分析（ssGSEA），发现低R-loop评分组的免疫原性细胞死亡途径（ICD）得分显着较低，表明免疫原性能力较弱（图3）。
低评分R-loop组中，功能失调的CD4+ 和CD8+ T细胞以及NK细胞的耗竭评分显着增加（图4）。细胞通讯分析表明，R-loop评分与CXCL16和CXCL2等恶性细胞的趋化因子水平显着正相关。其中21条细胞因子相关通路在R-loop分数高的恶性细胞中被显着激活，并且T细胞和/或巨噬细胞中的相关基因水平与这些通路的激活显着正相关（图5）。同时，通过TCGA-LUAD样本的RNA-seq数据发现，R-loop得分低的患者免疫细胞浸润水平较低，并表现出免疫反应相关因子、共刺激分子和MHC分子的下调以及共抑制分子的上调，支持了上述单细胞水平的研究结果。
与临床治疗结合，探究R-loop对酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗的影响
鉴于耐药性通过代谢重编程限制了TKI等药物的临床疗效，文章探讨了R-loop是否会影响药物的治疗效果。这里加入了新的单细胞数据集NCBI BioProject（PRJNA591860），包括30名接受TKI治疗的LUAD患者的49份组织样本：开始靶向治疗前（TN；n = 15）、完全或部分缓解状态（RD；n = 14）和疾病进展状态（PD；n = 20）。PD亚组的肿瘤样本已获得TKI耐药性。
根据92个R-loop调节因子的表达谱计算恶性细胞的R-loop评分。分数低的恶性细胞主要来自PD样本，而RD患者的R-loop评分明显较高。GSEA分析发现，炎症反应途径和免疫相关途径在具有高R-loop评分的RD患者中明显富集，而代谢相关途径在具有低R-loop评分的PD患者中显着富集（图6左）。同时，代谢相关通路在PD和RD亚组之间的激活表现出明显的差异。在R-loop评分较低的样本中，导致肿瘤进展的能量代谢途径显着丰富（图6中/右）。因此，能量代谢和R-loop评分之间的联系可能解释了恶性细胞的耐药状态。
在更多数据集和癌种中验证R-loop评分
文章进一步评估了R-loop对预后的影响，绘制了与R-loop评分相关的风险比（HR）曲线，发现R-loop评分在7个独立的LUAD队列中，可以作为有效的预后标志物。此外，文章还评估了TCGA数据集中来自33种肿瘤类型的9,757个肿瘤样本，单因素和多因素生存分析表明，低分组与几乎所有肿瘤类型的不良预后相关（图7）。为了探索R-loop评分模型预测癌症患者治疗效果的能力，文章选取了32个化疗、靶向治疗或免疫治疗的肿瘤RNA-seq数据集（包括11种肿瘤类型）。结果显示R-loop评分可以作为肿瘤治疗效果的有效预测指标。
实验验证
文章使用抗DNA/RNA混合抗体S9.6进行了DRIP-seq。在LUAD细胞系（PC-9）中，全基因组R-loop信号谱显示启动子区域的峰值读数数量高于其他区域。同时发现敲除R-loop调节因子FANCI明显改变了R-loop信号（这里没有清楚解释为何选择FANCI，图8）。此外，具有R-loop变化的基因在癌症进展相关通路中显着富集，文章进一步检测了Ras信号通路的活性，发现沉默FANCI明显减弱了Ras的活性，导致LUAD细胞中其下游PI3K/AKT/NF-kB和MAPK/ERK信号级联的强烈抑制。最后，细胞功能实验表明，FANCI沉默显著抑制PC-9和A549细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力，并促进细胞凋亡。异种移植研究表明FANCI沉默限制了PC-9细胞在体内形成肿瘤的能力。
虽然这篇文章中分析的数据都是来自公共数据库，用到的分析方法也较为常规，但是选择热门的R-loop作为切入点给这篇文章的创新性提高了一个层次。同时，分析中涉及到代谢重编程、酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗响应、泛癌种预后和免疫治疗影响，可谓是全面的阐释了R-loop对癌症进展的影响。最后，辅以细胞系和小鼠实验的验证。
参考文献
Zhang S, Liu Y, Sun Y, et al. Aberrant R-loop-mediated immune evasion, cellular communication, and metabolic reprogramming affect cancer progression: a single-cell analysis. Mol Cancer. 2024;23(1):11. Published 2024 Jan 10. doi:10.1186/s12943-023-01924-6 IF: 37.3 Q1
