01文章信息
发表杂志名称：Journal of Translational Medicine
中文标题：多组学数据揭示 SAA1 + 成纤维细胞通过调节巨噬细胞炎症和趋化作用加重牙周炎
英文标题：Multi-omics data reveal that SAA1 + fibroblasts exacerbate periodontitis by regulating macrophage inflammation and chemotaxis
影响因子：7.5
发表日期：2025 年 8 月 7 日
01研究概述
传统技术在分析牙周微环境中多种细胞类型间复杂相互作用机制方面存在局限，阻碍了牙周炎靶向治疗的发展。本研究通过整合牙周组织的单细胞 RNA 测序、空间转录组学和批量转录组数据集，系统描绘了炎症牙周微环境的空间结构和细胞间通讯网络，识别出对疾病进展起关键驱动作用的 SAA1 + 成纤维细胞亚群。结合生物信息学和体内外功能验证，揭示了该亚群的促炎作用、独特转录谱及其在牙周炎症中的机制贡献。结果表明，SAA1 + 成纤维细胞通过分泌相关信号分子介导髓系细胞浸润，敲除 SAA1 会影响细胞功能及炎症因子分泌，且其对巨噬细胞的作用可能与 NF-κB 信号通路有关。结论指出 SAA1 + 成纤维细胞的促炎特性及在促进巨噬细胞浸润中的作用，靶向 SAA1 为牙周炎治疗提供新方法
01研究结果
图 1：牙周组织单细胞图谱结果解读
作者构建了包含 65,979 个牙周组织细胞的单细胞转录组图谱，其中健康组织 33,023 个细胞，牙周炎组织 32,956 个细胞（图 1B）。去除批次效应后，不同样本和组间无明显批次效应。基于已确立的基因标记，这些细胞被分为六种主要类型，包括以上皮细胞（高表达 KRT1 和 KRT14）、内皮细胞（表达 VWF 和 PECAM1）、成纤维细胞（表达 DCN 和 COL1A1）、髓系细胞（表达 LYZ 和 HLA-DRA）、T/NK 细胞（表达 CD3D、CD3E 和 NKG7）、B / 浆细胞（表达 IGHG1 和 MS4A1）（图 1C 相关标记）。通过点图展示了这些细胞每个集群的前 5 个差异表达基因（图 1C）。GSVA 功能富集分析显示，基质细胞（包括上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞）在凋亡通路中显著富集，这可能导致牙周炎患者基质细胞数量减少；髓系细胞在炎症相关通路（如 TNFA 和 IL2-STAT5 信号通路）中显著富集，表明髓系细胞在牙周炎相关炎症反应中至关重要（图 1D）。该图全面呈现了牙周组织的单细胞景观及不同细胞类型的功能特征。
图 2：牙周炎中细胞空间定位变化结果解读
作者对牙周组织的空间转录组数据进行降维和聚类分析，健康样本分为 7 个集群（图 2A），牙周炎样本分为 5 个集群（图 2B）。通过多模态整合分析（MIA）对空间转录组数据进行解卷积，发现成纤维细胞和内皮细胞在健康组织的集群 1 和牙周炎组织的集群 3 中占主导，表明在牙周炎状态下它们在空间上更接近（图 2C、D）。在牙周炎组织中观察到的一个显著变化是髓系细胞向基质细胞区域的浸润增加，表明髓系细胞在牙周炎期间可能发生迁移（图 2D 红色框标记区域）。使用经典标记物（成纤维细胞的 COL1A1、内皮细胞的 PECAM1、上皮细胞的 KRT14、髓系细胞的 LYZ）确定基质细胞和髓系细胞的空间分布及位置关系，结果支持了髓系细胞在健康组织中相对聚集，在牙周炎组织中更分散的假设（图 2E 中红色圆圈突出显示区域）。该图揭示了牙周炎会诱导细胞空间位置发生变化，其中髓系细胞的迁移是疾病进展中的重要过程。
图 3：细胞通讯网络结果解读
作者对已识别的六种细胞类型进行了深入的 CellChat 分析，通过圆形图展示了牙周组织中细胞间相互作用的概况，线条越宽表示相互作用越频繁或越强（图 3A）。散点图显示了不同细胞类型 outgoing 和 incoming 相互作用的强度关系，发现髓系细胞是最活跃的信号接收者，而成纤维细胞是主要的信号发射者（图 3B）。将髓系细胞重新聚类为四个不同亚型，即树突状细胞（高表达 HLADRA1）、巨噬细胞（高表达 CD68 和 CD14）、中性粒细胞（表达 CXCL8）和肥大细胞（表达 TPSAB2）（图 3C 相关标记）。对包括髓系细胞在内的所有免疫细胞进行可视化，发现牙周炎样本中 T/NK 细胞的百分比低于健康样本，而其他免疫细胞群的百分比则有所增加（图 3C、D）。热图显示了不同组中各种细胞类型间相互作用的数量和强度差异（图 3E）。通路分析显示，在牙周炎组织中，炎症相关通路（如 IL-1、OSM 和 COMPLEMENT）以及趋化相关通路（如 SAA、CSF 和 CXCL）显著上调（图 3F）。多色免疫荧光实验显示，在炎症条件下，巨噬细胞（以 CD68 标记）和成纤维细胞（以 α-SMA 标记）的共定位增加（图 3G）。该图突出了牙周炎期间巨噬细胞和成纤维细胞之间通讯的显著变化，这可能与髓系细胞空间分布的改变密切相关。
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图 4：成纤维细胞亚型分析结果解读
作者通过 UMAP 分析识别出六种不同的成纤维细胞集群：四个成纤维细胞亚群、一个周细胞亚群和一个肌成纤维细胞亚群（图 4A）。周细胞亚群通过 RGS5 和 GO 术语 “内皮细胞分化” 进行注释，肌成纤维细胞亚群通过 ACTA2 和 GO 术语 “肌原纤维组装” 进行注释。CFD + 成纤维细胞和 SFRP4 + 成纤维细胞基于其特征基因进行注释，这些基因主要在与胶原形成和细胞外基质重塑相关的通路中富集（图 4B）。研究还确认了 CXCL13 + 成纤维细胞的存在及其促炎特性和在中性粒细胞募集中的作用，同时识别出一种新的 SAA1 + 成纤维细胞亚群，该亚群特异性表达 SAA1，且其表达谱与 CXCL13 + 成纤维细胞不同，是唯一在牙周炎期间比例显著增加的成纤维细胞亚群（图 4C）。对 SAA1 + 成纤维细胞的特征基因进行富集分析，发现其主要富集在淋巴和髓系淋巴细胞趋化中（图 4D）；KEGG 通路分析显示炎症相关通路（如 TNF 和 NF-κB 信号通路）显著富集（图 4E）。通过 AUC 评分评估 SAA1 + 成纤维细胞在空间转录组数据中的富集和定位，发现其表现出空间聚集性，主要富集在结合上皮下方的支持组织中，免疫组织化学结果也初步支持这一结论（图 4F、G）。该图识别出在结合上皮附近结缔组织中主要聚集的 SAA1 + 成纤维细胞亚群，其在促进白细胞趋化、髓系细胞迁移和响应 LPS 诱导的炎症信号方面发挥作用，可能在牙周炎进展中起关键作用。
图 5：巨噬细胞和成纤维细胞相互作用网络构建结果解读
作者对巨噬细胞进行降维聚类，基于其标记物表达将其分为四个亚群（图 5A、B）。在通讯网络中，四种成纤维细胞亚型在牙周炎条件下释放的信号更多（图 5C、D）。细胞间相互作用分析显示，SAA1 + 成纤维细胞在趋化因子相关信号通路（包括 CXCL、SAA 和 CSF 信号通路）中作为信号发送者发挥关键作用，FFAR2 + 巨噬细胞和 IFITM2 + 巨噬细胞是 CXCL 和 SAA 信号的主要接收者，而 C1QA + 巨噬细胞在接收 CSF 信号中起重要作用（图 5E-G）。CSF1-CSF1R 信号轴在健康组织中不显著，但在牙周炎中突出（图 5H）。通过 NicheNet 预测在牙周炎中起积极作用的配体 - 受体对，发现 SAA1 + 成纤维细胞是 IL-6、CSF1、ICAM1 和 BMP2 等配体的主要来源，这些配体可诱导炎症反应，而 CXCL13 + 成纤维细胞释放 CXCL2 和 ANGPT1 等配体（图 5I）。分析这些配体的潜在巨噬细胞受体，发现了重要的相互作用，包括 CSF1-CSF1R、IL-6-IL-6R、ICAM1-SPN 和 CCL2-CCR2（图 5J）。该图强调了 SAA1 + 成纤维细胞与巨噬细胞之间复杂的细胞间相互作用，这些相互作用加剧了牙周组织的炎症，靶向成纤维细胞 - 巨噬细胞相互作用网络可能是治疗牙周炎的一种有前景的策略。
图 6：牙周炎模型小鼠中 SAA1 表达验证结果解读
作者通过缝线结扎法成功建立了小鼠牙周炎模型（图 6A）。Micro-CT 分析显示，与未处理组（Control）相比，结扎组（Lig）上颌第二磨牙腭侧近中面的釉牙骨质界（CEJ）与牙槽嵴顶（ABC）之间的垂直距离（CEJ-ABC）显著增加（图 6B、C）。H&E 染色证实结扎部位软硬组织均有丢失，表明牙周炎模型建立成功（图 6B）。多色免疫荧光结果显示，SAA1 和 α-SMA 的共定位细胞即 SAA1 + 成纤维细胞（红色箭头指示）主要集中在根侧结合上皮（JE）下方的结缔组织中（图 6D）。对小鼠牙龈组织的 mRNA 和血清分析显示，在转录组水平上，SAA1 和炎症因子（TNF-α 和 MMP9）的表达水平显著升高（图 6E-G），小鼠血清中 SAA1 的浓度也显著增加（图 6H）。该图通过体内实验验证了牙周炎模型小鼠中 SAA1 的上调表达，为进一步研究 SAA1 + 成纤维细胞在牙周炎发病机制中的具体作用提供了基础。
图 7：SAA1 敲除（L929-KO-SAA1）细胞的表型特征和验证结果解读
作者通过 CRISPR-Cas9 技术建立了稳定的 SAA1 敲除 L929 细胞系（L929-KO-SAA1）。RT-qPCR 和 Western blotting 分析表明，L929-KO-SAA1 细胞中 SAA1 的表达显著低于 L929 细胞，证实了 SAA1 的成功敲除（图 7A、B）。RT-qPCR 结果显示，SAA1 敲除导致 L929 细胞中炎症细胞因子 IL-6 和 TNF-α 的表达显著降低（图 7C、D）。Transwell 和伤口愈合实验评估细胞运动能力，发现 SAA1 敲除后 L929 细胞的迁移明显减少（图 7E、F、H、I）。CCK-8 测定显示 SAA1 敲除显著抑制细胞增殖（图 7G）。Western blot 分析进一步揭示，SAA1 敲除通过 TLR4/TLR2/MyD88 信号轴下调炎症反应（图 7J-N）。该图表明，在 L929 细胞中敲除 SAA1 基因显著降低了其迁移能力，增强了增殖潜力，并通过 TLR4/TLR2/MyD88 信号通路减轻了炎症反应。
图 8：共培养实验证实 L929-KO-SAA1 对巨噬细胞功能的影响结果解读
作者获取 L929 和 L929-KO-SAA1 细胞的条件培养基，并用于培养 RAW264.7 细胞（图 8D）。细胞迁移实验表明，SAA1 敲除显著降低了 L929 细胞对巨噬细胞的趋化吸引能力（图 8A-C）。RT-qPCR 结果显示，与 L929 细胞条件培养基共培养相比，与 L929-KO-SAA1 细胞条件培养基共培养的 RAW264.7 细胞中 TNF-α 和 IL-6 mRNA 的表达水平更低（图 8E、F）。RNA 测序结果（图 8G）和免疫荧光分析一致显示，L929-KO-SAA1 细胞条件培养基诱导的 M1 极化显著低于 L929 细胞条件培养基，但诱导 M2 极化的能力无差异（图 8I 及相关补充图）。对 SAA1 + 成纤维细胞特征基因的 GSEA 分析显示，TNFA 通过 NF-κB 信号通路显著富集（图 8H）。Western blotting 证实，与 L929 细胞条件培养基培养的细胞相比，L929-KO-SAA1 细胞条件培养基培养的 RAW264.7 细胞中 NF-κB 信号通路显著下调，而添加重组小鼠 SAA1（rmSAA1）可逆转 NF-κB 通路的下调（图 8J、K）。该图表明，SAA1 敲除影响成纤维细胞与巨噬细胞之间的通讯，导致巨噬细胞趋化性和促炎反应降低，且这些效应可能由 NF-κB 通路介导。
图 9：分子对接和药物功能验证结果解读
作者通过 DGIdb 数据库筛选出两种潜在的靶向 SAA1 的药物，即阿那白滞素（AN）和萘普生钠（NS）。分子对接分析表明，AN 和 NS 与 SAA1 的结合能分别为 - 4.84 kcal/mol 和 - 3.78 kcal/mol（图 9A、B），且它们与 SAA1 蛋白形成了氢键相互作用。CCK-8 测定结果表明，在 AN 浓度为 400 ng/mL 和 NS 浓度为 5 µM 时，细胞仍具有良好的增殖活性（图 9C、D）。RT-qPCR 结果显示，与对照组相比，SAA1 基因敲除显著抑制了 L929 条件培养基诱导的 TNF-α 和 IL-6 炎症因子的表达，且 L929-KO-SAA1 条件培养基与 AN/NS 联合使用对巨噬细胞中 TNF-α 和 IL-6 的抑制作用显著强于未敲除组，但与单独使用 SAA1 敲除条件培养基组相比无显著差异或差异较弱（图 9E-H）。该图表明 AN/NS 可能通过靶向 SAA1 抑制巨噬细胞中炎症因子的表达，从而发挥抗炎作用，提示靶向 SAA1 的治疗策略可能为调节炎症反应提供新方向。
本研究整合单细胞 RNA 测序、空间转录组学、批量 RNA 测序及实验技术，多角度全面探究牙周炎炎症微环境。通过构建包含大量牙周组织细胞的单细胞转录组图谱，识别出 SAA1 + 成纤维细胞亚群，该亚群在牙周炎中比例显著增加，具有促炎和趋化特性，通过多种信号通路介导髓系细胞浸润等。体内实验验证了牙周炎模型小鼠中 SAA1 的上调表达，体外实验表明敲除 SAA1 会影响细胞功能及炎症反应，共培养实验揭示 SAA1 + 成纤维细胞通过 NF-κB 通路影响巨噬细胞功能，还筛选出潜在靶向 SAA1 的药物。研究明确了 SAA1 + 成纤维细胞在牙周微环境中的作用，为理解牙周组织内细胞相互作用及开发牙周炎靶向治疗策略提供了科学基础，但也存在数据整合可能引入偏倚、样本量有限等局限性。
