说明：此篇笔记系2016-2017年由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂整理而成，侵删。该课程由复旦大学生物医学研究院（IBS）的刘晓慧博士所授。

主要知识点：
--自动化样品前处理的新方法一：StageTips
--自动化样品前处理的新方法二：PCT压力循环系统
--样本前处理总结

背景介绍

自从进入了精准医学时代，蛋白质组学的发展也朝着精准医学临床应用的方向在不断发展。

我们知道，在临床应用领域，常常需要用更多的样品量来进行研究分析，得到更多的结果。比如，用几十上百例的蛋白质组学样品来进行肿瘤分析。2014年Nature上发表过一篇文章，做了95例大肠癌的分析，通过label free结果对95例进行分型。与之前的ATGC方法把大肠癌分成四个型比起来，蛋白质组学的方法可以更精准地分成五个型。这也是蛋白质组学在精准医学领域一个很好的应用实例。
（Bing Zhang, Jing Wang, et al, Proteogenomic characterization of human colon and rectal cancer，nature,2014,3,382）

接下来我们分享两种新方法，都可以实现简单、可重复且自动化的样品前处理效果。

StageTips

第一种方法最早发表于2007年，到今年已经成立了一家公司，将这种方法发展出来的装置很好地商业化了。

image

当时，整套装置还需要手工来组装。不过组装的方法也非常简单，根据上面的图，分五步走:

第一步:准备好一张3M的C18过滤膜，一个枪头，一个平口的针头和一个长手柄；

第二步+第三步：在3M膜上取出一个小孔的膜，

第四步：将膜捅到EP管里面，用气把它压紧了，形成一个小的膜系统。

第五步：取出手柄和针头，带膜的枪头就完成了。

C18过滤膜有脱盐的效果，可以把蛋白质或肽段截留在上面，通过水或BUFFER体系把盐洗掉，之后再通过有机相把肽段或蛋白从C18膜上洗脱下来。

除了C18膜，还有很多种类型的膜，比如强阳离子膜、阴离子膜等。大伙儿看看下面这个图，感受一下这些膜的名字和成分。

image

这里的柱状图是对比不同的膜处理后能鉴定到的肽段的数量，左图是肽段水平的鉴定，右图是蛋白水平的鉴定，差别都不太大（图里的fr1，2，3是指馏分）。通过这个膜系统，可以进行分级分离，也可以进行脱盐。

时间走到2009年，又出现了一种新的FASP（ filter-aided sample preparation）方法。之前的Stagetips只是为了进行分级和富集，而FASP可进行酶解（文献见下图）。

image

到了2014年，这个团队又将StageTips和FASP方法结合起来，实现了所有的实验都在这个小管子里完成，样品加入后先清洗，然后还原，清洗，烷基化，再清洗，最后酶解。酶解后的肽段一直留在下图的“Reaction chamber”里，然后将肽段通过下方的膜脱盐，洗脱，或者直接通过它进行馏分的分离，收集样品。

image

四次重复实验检测发现，用这种装置做下来，四次都能被重复的蛋白有92.9%，只有1.6%的蛋白是其中任意一次单独鉴定到的，1.5%是其中两次鉴定到的，4.0%是其中三次鉴定到的。如果我们考虑到这个实验一共鉴定到了9,667个蛋白（human proteins），在保证了较高的鉴定率的前提下，92.9%的四次重复率已经相当不错了！并且信号强度也比较一致。由于管子体积的限制，这套装置很适合少量样品的分析。

image

该方法已经商业化。2016年Cell Systems上发表了一篇用这套商业化的装置做的血液样品案例。如下图，把血液样品取出来后，直接加到装备了膜系统的EP管里。通过优化整个酶解系统，整个前处理过程2个小时之内就能完成，其中裂解与还原烷基化是同时完成的。完成之后通过一个自动化仪器，进入质谱，经过0.5小时的质谱实验，以及15分钟的结果分析，最后鉴定到了300多个常规的中高丰度蛋白（这个例子中没有对血液中的高丰度蛋白进行去除）。

image

同样的，文章里也对这次实验进行了重复性评估，见下图。

image

从图上看，鉴定的重复性特别好，尤其是49种FDA批准的Biomarkers中，有41种的CV值都小于20%，说明这些biomarkers可以通过该方法可重复地检测到。这个方法被认为很有希望发展为高通量样品处理的方案。

Tips:
CV值：Coefficient of Variation，反映数据离散程度的绝对值。在进行数据统计分析时，如果变异系数大于15%~20%，则要考虑该数据可能不正常，应该剔除 。

image

以上是该公司的网址，有兴趣的小伙伴可以登上去看看。目前最新的进展是，重复性可以到0.99，样品处理时间缩短到了1个小时，再加上20分钟的质谱分析，总体实验时间得到了很好地控制，实现了简单快速高效且可重复的要求！我们期待这个方法能早时用到临床样品的检测上。

PCT压力循环系统

第二种新方法叫PCT压力循环系统。

刚才讲到，可以通过压力差来进行样品的破碎和蛋白的提取。另外，我们知道，在高压条件下，很多反应是会提高效率的，比如说酶解、还原烷基化、样品裂解等。下面这篇文章通过分析穿刺的样品（量非常少，大概只有1立方毫米），放到PCT装置里，通过样品的处理，还原烷基化，酶解，酶解之后脱盐，取出，直接进行SWATH分析。

image

我们来看下这种方法的结果评估。图示上方的a 图表明结果的SD（样品标准差）都很小，说明检测结果很精确；b图表明漏切的位点也很少.

图示下方的a图表明，可重复性CV值基本上都小于20%，只有其中两次的重复性实验中差异大了一点。

文章里用这个方法分析了9对胃癌的癌症与癌旁组织，然后找到了一组蛋白成为癌症的潜在标志物。

image

以上是两种在蛋白质临床检测方面非常有前途的方法，都实现了快速、高通量、高重现性，自动化的处理，感兴趣的童鞋可以重点关注一下。

第二讲总结

最后，我们对整个第二讲的内容进行一个小结，如下图：

image