从reads counts手动计算TPM

------------------------------------TPM 定义-------------------------------------------------

首先了解一下什么是TPM；
TPM：Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts)

分析
TPM的计算方法其实同RPKM很类似，同样的对基因长度和测序深度进行标准化，只不过RPKM是先进行测序深度标准化，后进行基因长度标准化；而 TPM是先进行基因长度标准化，后进行测序深度标准化 。事实证明，TPM的标准化方法更有优势，为何会这样，见后述。这里先看看TPM的计算。

例子

image.png

image.png

第二歩：计算总Read数（RPK）。计算总Read数，并将其进行百万转换。由于基因数太少，这里是使用10模拟百万转换。

由于TPM先进行基因长度标准化，所以这里的总Read数计算已经变为基因长度标准化后的Read数，也就是RPK数。

image.png

第三步：进行总Read数标准化。将Rep1、Rep2、Rep3的RPK除以各自的转换后的总Read数，得到TPM值。

TPM的计算方法
标准化基因长度：将所有基因的Read数除以基因长度（基因长度单位为kb）；

计算总Read数：计算每一个样本的总Read数，然后将其换算为以百万位单位（M）；

标准化总Read数：将所有基因的Read数除以总Read数；

TPM特点

image.png

------------------------------------TPM 计算------------------------------------------

采用如下perl脚本：
首先数据格式：

1.基因长度（gene length）数据格式如下：

image.png

2.Reads count 数据格式如下，其中sample数码没有限制：

image.png

----------------------------------代码如下-------------------------------------------------

#----------------------------------------------------------------------
#usage：perl gene_leng_file   reads_count_files Ouput_file

#其中 gene_length_file没有表头，格式如下：

#Gene1  2312
#Gene2  3212

#其中 reads_count_files 有表头，格式如下：

#GeneID sample1 sample2 sample3
#Gene1    22    2123    122
#Gene2    21    112     1233
#Gene3    211   2112    31233
#-----------------------------code--------------------------------------


open FA,"$ARGV[0]"; #打开基因组length文件

while(<FA>){
chomp;
my($id,$len)=split /\t/,$_,2;

#print "$id\t$len\n";

$len{$id}=$len/1000;
}

open FA1,"$ARGV[1]"; #打开reads count文件

$head=<FA1>;#去除行名,并获得其内容，后面打印用
while(<FA1>){
chomp;

my ($ID,$count)=split /\t/,$_,2;

@{$hash{$ID}}=split /\t/,$count;

}

$n=0; #用于计算$s
$m=0; #用于计算$s

foreach $leng(keys %len){

foreach (@{$hash{$leng}})
{
$_=($_)/($len{$leng});

#print "$leng\t$_\n";

$n+=1;
}
$m+=1;
}

$s=$n/$m; #两次循环使得列数变为$n,所有要除以$m,;

#print "$s\n";

my %ALL=();

for($i=0; $i<= $s-1;$i+=1){

$total=0;

foreach $leng(keys %len){

$total+=${$hash{$leng}}[$i]; #计算每一列的总reads count数（均一化基因长度以后的）
}
#print "$total\n";

$ALL{$i}=$total; #每一列对应一个总的reads count，存到%ALL中
}



foreach $leng(keys %len){
#print "$leng\n";

$index=0;

#print "$ALL{$index}\n";

foreach (@{$hash{$leng}})
{

#print "$_\n";

$_=($_*1000000)/($ALL{$index}); #计算TPM值；

#print "$leng\t$_\n";

$index+=1;

}

}



#foreach $leng(sort keys %hash){

#$data=@{hash{$leng}};

#print "$leng\t",join ("\t",@{$data}),"\n"; #打印数据
#}


open OU ,">$ARGV[2]";

print OU "$head"; #打印行名，不需要加换行，因为读的时候以及读入换行符号了

foreach $leng(sort keys %len){ #打印数据，这里不能直接调用%hash,需要调用#%len；很奇怪

print OU "$leng\t"; #打印基因名

foreach (@{$hash{$leng}}) #循环打印每个基因对应的几列数据
{


printf OU "%.3f", "$_"; #设置小数位3位
print OU "\t";
}
print OU "\n" #打印完成后，换行！
}

输出结果

image.png

以上关于TPM定义，参考https://www.jianshu.com/p/1940c5954c81