生信小课堂
影响因子：7.4
背景：皮肤黑色素瘤（SKCM）是最具侵袭性的皮肤癌，占皮肤相关癌症死亡率超过75%。作为新发现的程序性细胞死亡，细胞焦亡已被发现与肿瘤进展密切相关。然而，SKCM中细胞焦亡的预后意义仍然难以捉摸。
方法：从癌症基因组图集（TCGA）和基因型组织表达（GTEx）数据库共获得了469个SKCM样本和812个正常样本。首先，确定了正常样本和SKCM样本之间不同表达的细胞焦亡相关基因（PRG）。其次，建立了一个基于单变量Cox和LASSO Cox回归分析的预测模型，该模型在GSE65904的测试队列中得到了验证。第三，使用诺莫图来预测SKCM患者的生存概率。R包“pRRophetic”用于识别低风险和高风险群体之间的药物敏感性。最后，在A375和A2058细胞中探索了GSDMD和SB525334的功能。
结果：基于单变量Cox和LASSO回归分析，建立了一个八个PRG（AIM2、CASP3、GSDMA、GSDMMC、GSDMD、IL18、NLRP3和NOD2）的预测模型，该模型在测试队列中得到了验证。SKCM患者根据风险评分中位数分为低风险组和高风险组。Kaplan-Meier生存分析显示，高风险患者的总体生存率低于低风险患者。此外，时间依赖的ROC曲线验证了风险模型在预测SKCM预后时的准确性。更重要的是，确定了4种小分子化合物（SB525334、SR8278、Gemcitabine、AT13387），这可能是不同风险群体患者的潜在药物。最后，GSMD和SB525334治疗的过度表达抑制了SKCM细胞的增殖、迁移和入侵。
结论：在这项研究中，作者构建了一个基于PRG的预后模型，并将GSDMD确定为潜在的治疗目标，这为SKCM治疗提供了新的见解。
流程图：
研究结果：
一、SKCM中差异表达的PRG的识别
从TCGA数据库获得了469名SKCM患者，从GTEx数据库获得了812个正常组织。根据使用R包“DESeq2”的33个PRG的|log2 FC | > 1.5和P < 0.05的截止标准，共确定了23个差异表达的PRG。火山图和热图显示，10个PRG受到显著上调，而13个PRG在SKCM中受到下调（图2A，B）。这23个差异表达的PRG之间的相关性显示在PPI网络和相关矩阵中（图2C，D）。此外，在这些差异表达的PRG中观察到SKCM患者的突变（图2E）。
二、功能富集分析
进行了GO和KEGG路径富集分析。根据GO富集分析，这些不同表达的PRG主要与参与凋亡过程的细胞焦亡、炎症体复合体和半胱氨酸型内肽酶活性有关。此外，KEGG的分析表明，这些差异表达的PRG与百日咳、军团病和NOD样受体信号通路有关。
三、基于训练队列中PRG的预后模型的构建
如图3A所示，确定了11个P < 0.05的PRG，包括两个潜在的危险基因（GSDSA、GSDSC）和9个潜在的保护基因（NLRP1、GSDMD、IL18、NOD2、AIM2、NLRP3、SCAF11、GSDBMB、CASP3）。作者进行了LASSO回归分析，并确定了八个PRG作为候选预后因素，包括GSDMA、GSDMC、GSDMD、NLRP3、IL18、NOD2、AIM2和CASP3（图3B，C）。使用这八个PRG构建了PRG预后模型。基于PRG的预后模型制定如下：风险评分 = [GSDMC × 0.1964] + [GSDMA × 0.1037] + [NLRP3 × 0.0283] + [GSDMD × (− 0.1879)] + [IL18 × (-0.1649)] + [NOD2 × (− 0.0816)] + [AIM2 × (− 0.0518)] + [CASP3 × (− 0.0608)]。
根据中位风险评分的阈值将456名患者分为低风险组（n = 228）和高风险组（n = 228）。与低风险组相比，高风险组的患者死亡率更高，存活时间更短，这表明更高的风险评分与预后较差有关。GSDMD、IL18、NOD2、AIM2、NLRP3和CASP3在高风险组中表现不佳，而GSDMA、GSDMC在高风险组中表现高（图3D）。Kaplan-Meier
生存曲线还表明，高风险组的患者预后较差（图3E）。时间依赖的ROC曲线表明，OS的预后准确性在1年时为0.693，5年时为0.699，10年时为0.709（图3F）。
四、测试队列中预后模型的验证
与高风险组的患者相比，低风险组患者的死亡率更低，OS时间更长，这表明较低的风险评分与更好的预后有关（图4A）。此外，Kaplan-Meier生存分析还表明，不同风险组的患者具有不同的预后，这与训练队列的结果一致（图4B）。最后，时间依赖的ROC曲线表明，OS的预后准确性在1年为0.560，5年为0.570，在10年为0.660（图4C）。
五、诺模图和校准曲线的构建
作者开发了一种结合风险评分和病理特征的诺模图。在各种临床参数中，风险评分为显著影响因素（图5A）。此外，校准曲线证明了其高度预测效率（图5B-D）。与传统的预后评分系统相比，该模型具有最高的AUC值（AUC = 0.600，图5E）。
六、低风险和高风险群体的药物敏感性分析
有47种小分子化合物在低风险组和高风险群体之间表现出显著不同的反应。前四个小分子化合物被发现在低风险和高风险群体之间具有最显著的折叠变化，包括SB525334(6A），SR8278（6B），Gemcitabine（图6C），AT13387（图6D）。低风险组的SKCM患者对Gemcitabine和AT13387表现出更高的敏感性，而高风险组的患者对SB525334和SR8278表现出更高的反应。作者可视化了这四个小分子的三维构象（图6E-H）。
七、Kaplan-Meier预后基因曲线
作者为这些基因生成了Kaplan-Meier曲线。研究结果表明，AIM2、GSDMD、IL18、NLRP3和NOD2的高表达水平与SKCM患者的预后良好有关，而CASP3、GSDMA和GSDMC的表达水平对预后没有显著影响。
八、保护性PRG筛选和功能识别
为了确定SKCM的预后因素，使用单变量Cox回归分析中确定的重要预后因素进行了多变量Cox回归分析。总共确定了三个PRG，其中两个是潜在的保护基因，其中一个是潜在的风险基因（图7A）。SKCM中GSDM MD mRNA表达的平均水平高于正常皮肤（图7B）。GSDMD的增强表达也得到了免疫组织化学证实（图7C）。
WB结果显示，GSDMD蛋白在GSMD超表达组（OE-GSDMD）中显著增加，而SB525334治疗对GSMD的表达影响不大（图7D）。随后，分析了细胞死亡和细胞活力。FCM分析表明，GSDMD或SB525334治疗的过度表达不会引发SKCM细胞的明显细胞死亡（图7E）。然而，CCK8检测显示，OE-GSDMD组和SB525334治疗组中这两个细胞系的生存能力下降（图7F）。Ki67的免疫荧光染色还证实，OE-GSDMD和SB525334组SKCM细胞中Ki67的表达显著减少，表明GSMD和SB525334治疗的过度表达会降低细胞增殖（图7G，H）。进行了Transwell迁移检测，结果显示，GSDMD过度表达和SB525334治疗降低了SKCM细胞的迁移能力（图7I，J）。此外，使用检测细胞侵袭能力，说明GSDMD过度表达和SB525334治疗降低了SKCM细胞的侵袭能力（图7K，L）。
九、肿瘤微环境分析和免疫治疗
作者用CIBERSORT工具计算了SKCM患者的22个免疫细胞浸润程度，结果显示，高风险组的浆细胞、CD8 T细胞、活化的CD4记忆T细胞、调节性T细胞、活化的NK细胞和巨噬细胞M1的渗透水平低于低风险组，而高风险组的静息NK细胞、静息的CD4记忆T细胞、静息的肥大细胞和巨噬细胞M2的渗透水平高于低风险组（图8A）。进一步分析了GSDMD表达和CD4表达之间的关系，Spearman相关性分析表明，GSDMD水平和CD4水平之间存在显著的正相关性（图8B）。此外，免疫荧光分析表明，GSDMD在SKCM组织中与CD4高度共表达（图8C）。
低风险组和高风险组之间IC的表达存在显著差异，几乎所有IC在低风险组中都表现出高表达水平（图8D）。
IPS是一种广泛用于免疫反应预测的算法。根据PD1和CTLA4表达将所有患者分为4组：CTLA4_negative_PD1_negative、CTLA4negative_PD1_positive、CTLA4_positive_PD1_negative和CTLA4_positive_PD1_positive。结果显示，所有四组低风险评分的患者都有更高的IPS评分（图8E-H）。
研究总结：本研究中，作者构建了一个基于AIM2、CASP3、IL18、NLRP3、NOD2、GSDMA、GSDMC、GSDMD基因的预后模型，这些基因有效地预测了SKCM患者的预后。作者根据预后模型中患者的分层筛选了不同的小分子化合物。体外实验结果表明，GSDMD和SB525334治疗的过度表达可以抑制SKCM细胞的增殖、迁移和入侵。
