CRISPR/Cas9的出现使得高效进行精确、有针对性的基因组修改变得比以往更加容易。Cas9已被修改，使研究人员能够敲除，激活，抑制，甚至图像你最喜欢的基因。但是，在提供如此广泛的 Cas9 试剂时，您如何选择适合您特定实验的 Cas9？此博客文章将帮助您熟悉通过 Addgene 存储库提供的广泛 Cas9s，并便于选择适合您使用的 Cas9 试剂。

在任何CRISPR实验中，要做的第一件事就是确定你到底想做什么。您是否试图永久淘汰细胞类型或生物体中的基因？您是想在不永久修改基因组的情况下减少特定基因的表达吗？尝试在特定点激活是否更有意义？在特定位置修改表观基因组怎么样？正如您所料，这个问题的答案将极大地影响您决定您的实验需要哪个 Cas9。以下是使用Cas9和特定Cas9进行的几种常见基因操作的简要摘要。

为您的淘汰实验选择 Cas9

克里斯珀挖空一代

使用标准 SpCas9 进行基因淘汰

****敲出细胞或动物是通过共同表达特定于要瞄准的基因和内分泌酶Cas9的gRNA而形成的。基因组靶点可以是任何 +20 核苷酸 DNA 序列，只要它满足两个条件： 1） 序列是独特的相比，其余的基因组。2） 目标位于原空间器相邻图案 （PAM） 的正上游。SpCas9 是一个常见的选择，当有一个合适的目标位点，很少关心偏离目标的影响（例如，最佳 gRNA 设计与最小的同源位点在整个基因组）。Addgene 携带各种含有质粒的 SpCas9，这些质粒经过优化，可在细菌、酵母、蠕虫、果蝇和哺乳动物中进行基因组工程实验。****

对特异性的关注？考虑使用高特异性Cas9变种。

通过正确设计您的 gRNA 序列，可以增强 Cas9 介质的特异性。即选择基因组中其他部位具有最小同源性的目标序列。已采用各种方法进一步提高Cas9的特异性。例如，Cas9-nickase （Cas9n） 利用了 Cas9 通过两个核糖域（RuvC 和 HNH）的组合活动进行双链断裂 （DSB） 这一事实。将两个关键酶残留物之一转换为丙氨酸（D10A 或 H840A）会生成一个"刻痕"Cas9，无法生成双链断裂。因此，需要两个正确定位的Cas9n分子才能在靶点高效创建DSB，与野生型SpCas9相比，它大大提高了特异性。

虽然Cas9n肯定比野生型SpCas9更具体，但当只有一个gRNA与Cas9n表达时，在目标地点仍然能够检测到DSB。这意味着 Cas9n 有可能在其任何 gRNA 的偏离目标站点之一绑定并导致一个因德尔。人们可以通过使用核酸酶死Cas9（dCas9）融合到非特异性内分泌酶FokI来克服这一限制。福基只有在变暗时才会切开目标DNA。因此，dCas9-FokI基本上需要在发生任何裂痕之前，在目标部位正确定位两个dCas9-FokI分子;dCas9-FokI在单个gRNA指定的偏离目标处切割的可能性比Cas9n要小得多。

******Cas9n 或 dCas9-FokI 方法的一个明显局限性是，它们都需要两个合适的目标序列才能有效地生成 DSB。几个实验室，包括张峰在布罗德研究所的实验室和Keith Joung在MGH的小组，已经使用结构生物学来识别关键残留物，以调解Cas9的切开目标点的能力。所谓的增强 Cas9 （张）或高保真 Cas9 （ Joung ）在目标点与野生型 SpCas9 具有可比的活动，但大大减少了偏离目标的活动。这些 Cas9 变种可增强特异性，而无需在目标点内需要两个或多个相邻目标点。更多关于增强特异性Cas9变种的信息可以在我们的博客文章中找到，题为"增强CRISPR目标特异性与eSpCas9和SpCas9-HF1"。******

当没有 5'NGG'3 PAM 序列存在时，我该怎么办？

• 合成Cas9s与新颖的PAM识别

通过一系列细菌中的阳性选择屏幕，Keith Joung 的小组识别出识别新型非 NGG PAM 序列的 S. Pyogenes Cas9 突变体（VQR、EQR 和 VRER Cas9 变种）。重要的是，VQR、EQR 和 VRER Cas9 变种能够修改无法使用野生型 SpCas9 进行修改的基因组位点，并且它们对 PAM 变异的特异性类似于人类细胞中几个基因组靶点的野生型 SpCas9。包括VQR、EQR和VRER SpCas9变种，有效地使人类基因组中CRISPR/Cas9的目标范围翻倍。更多关于各种合成Cas9s可以通过Adgene可以找到我们的博客文章题为"PAM要求和扩大CRISPR超越SpCas9"。

• 非 S. 皮奥根斯卡斯 9s

除了典型的 NGG PAM 序列之外，其他 Cas9 同源已从各种细菌物种和许多结合的 PAM 序列中分离出来。所谓的"非Sp"Cas9s可能更适合你的实验，原因不是PAM序列。例如，金黄色葡萄球菌（SaCas9）的Cas9编码序列比SpCas9小约1公斤基，SpCas9允许包装成腺相关病毒（AAV），这是目前基因治疗的黄金标准。重要的是要记住，非SpCas9s只与来自同一物种的tracRNA和crRNA（或合成gRNA）兼容。更多有关通过Addgene提供的各种非SpCas9的信息，可以在我们的博客文章中找到题为"PAM要求和扩大CRISPR超越SpCas9"。

• 非卡斯 9 克里斯普内多内分泌酶， Cpf1

注意：Cpf1 也称为 Cas12a。

Cpf1 是单个 RNA 引导的封闭体

********上述大多数Cas9变种已用于通过同源定向修复（HDR）途径生成特定的基因编辑。有关如何使用 CRISPR 生成特定基因编辑的更多信息，请参阅我们的CRISPR 指南页面。********

使用Cas9激活和抑制目标基因

Cas9的一个独特方面是它能够结合目标DNA，而独立于它切割目标DNA的能力。换句话说，含有破坏 DNA 的突变的 Cas9 （ SpCas9 的 D10A 和 H840A ）仍然能够结合目标 DNA 。此外，所谓的核糖核酸死Cas9或"dCas9"可以用作平台，通过将各种货物直接融合到dCas9，将各种货物运送到特定的DNA位位。dCas9的这一特性已被利用来定位各种蛋白质以靶向基因，包括转录活化剂和转录抑制剂。

使用基于 dCas9 的抑制器抑制目标基因

早期在细菌中使用 dCas9 的实验表明，将 dCas9 定位为转录启动点足以通过阻止转录启动来"抑制"或"击倒"转录。在哺乳动物细胞中，强力抑制需要将带有转录抑制剂标记的dCas9定位到感兴趣的基因的发起区域。在敲除目标基因对细胞有毒时，您可能需要考虑使用基于 dCas9 的抑制剂，包括 dCas9-KRAB。在Addgene的网站上可以找到抑制各种物种和细胞类型目标基因的质粒。

使用基于 dCas9 的激活器激活目标基因

**********基于 dCas9 的激活器阵列非常多样化。最简单的激活器由 dCas9 融合到单个转录激活域（通常为 VP64）。最近开发出第二代活化剂，这些激活器使用几种不同的方法改变基因表达。例如，"SunTag"系统通过共同表达标记为 dCas9 的表位和抗体活化剂融合蛋白，促进将多个激活领域招募到同一遗传细胞位。协同激活介导器复合物由 dCas9-VP64 融合和能够与附加的 RNA 绑定转录激活器交互的修改 gRNA 组成。额外的质粒激活各种物种和细胞类型的靶基因可以在Addgene的网站上找到。**********

好吧，我选了一个Cas9！我下一步做什么？

您选择了适合您的实验的 Cas9。你接下来做什么？这里有一些考虑，这将有助于您推进您的CRISPR实验。

设计或选择 gRNA - Addgene 可能已经携带了来自您最喜爱的物种的"验证 gRNA"。 经过验证的 gRNA 已在实验中成功使用，并发表在同行评审的期刊上，在开始 CRISPR 实验时将节省您的实验室时间和资金。如果您需要为您的实验生成新的 gRNA，您可以从各种"空 gRNA 向量"中进行选择，并使用众多免费 gRNA 设计程序之一设计您的 gRNA 定位序列。

我应该使用哪种类型的表达系统或交付方法？为您的实验选择合适的Cas9试剂只是一半的战斗 - 现在你必须选择适当的表达系统，并将Cas9交付给你的目标细胞！Addgene 携带各种 Cas9，其中含有质粒，这些质粒经过优化，可在不同物种和细胞类型中表达，包括（但不限于）细菌、酵母、植物、果蝇、蠕虫和哺乳动物（这里按模型有机体浏览质粒）。对于难以转染的细胞类型，您可能需要考虑使用伦蒂病毒将Cas9传送到目标细胞。更多关于哺乳动物细胞各种输送系统的信息可以在我们的博客文章中找到，题为"CRISPR 101：哺乳动物表达系统和交付方法"。

************验证您的基因组编辑 - 一旦您将 Cas9 和 gRNA 传送到目标细胞，是时候确认目标序列已修改！确切的协议可能因您的特定实验而异，但在我们的博客文章"CRISPR 101：验证您的基因组编辑"中可以找到您验证基因组编辑的各种方式的广泛概述。************