01文章信息

发表杂志名称：Advanced Science

中文标题：单细胞 RNA 测序鉴定 MMP11 + 癌症相关成纤维细胞为血管生成和膀胱癌进展的驱动因素

英文标题：Single-Cell RNA Sequencing Identifies MMP11+ Cancer-Associated Fibroblasts as Drivers of Angiogenesis and Bladder Cancer Progression

影响因子：14.1

发表日期：2025 年 6 月 24 日

01研究概述

本研究通过单细胞 RNA 测序鉴定出一种新的 CAF 亚群 MMP11+ mCAF，其在膀胱癌进展过程中逐渐积累，且与不良预后显著相关。该细胞群通过 WNT5A-MCAM 信号轴调节尖端内皮细胞簇（ESM1+tEC）的迁移，并调节关键转录因子 SOX18、NFIC 和 HOXB9 的表达。此外，MMP11+ mCAFs 通过 CCL11/CCL2 招募 SPP1 + 巨噬细胞，促进 VEGFA 分泌，进一步增强 ESM1+ tECs 的促血管生成活性。干扰素相关基底样肿瘤细胞分泌 BMP2，诱导 MMP11+ mCAFs 特异性转录因子 NFE2L3 的表达和活性，促进 WNT5A 表达。小鼠实验证实，抑制 BMP2 可抑制膀胱癌的肿瘤血管生成和生长。泛癌分析显示，MMP11+ mCAFs 存在于多种癌症类型中，包括乳腺癌、肺腺癌、胃癌和结直肠癌。这些发现为 CAFs 的异质性及其在肿瘤进展中的调节作用提供了见解，为 CAF 靶向治疗提供了新的潜在治疗靶点，在多种癌症中具有广泛的适用性。

01研究结果

图 1：与膀胱癌进展相关的高风险（HR）基因集的鉴定

作者分析了 TCGA-BLCA 队列中 III/IV 期和 I/II 期肿瘤之间的差异表达基因（DEGs），鉴定出 107 个上调基因和 18 个下调基因。单变量 Cox 回归分析显示，59 个上调的 DEGs 与不良预后相关，7 个下调基因与良好预后相关，这些 59 个上调基因被指定为 HR 基因集，其在 III/IV 期肿瘤中表达显著更高（图 1A、1B）。

作者通过 Kaplan-Meier 生存分析证实，HR 表达升高与 TCGA-BLCA 队列中总生存率降低相关（HR=2.068，95% CI=1.516-2.822，p=4.53e-6）（图 1C）。

为了研究 HR 基因集的细胞表达模式，作者构建了一个包含 29 个膀胱肿瘤和邻近正常组织的单细胞 RNA 测序文库以及两个公开可用的数据集，经过严格的质量控制和批次校正后，184,996 个细胞被聚类为 29 个亚群，并根据已建立的标记基因分为六种主要细胞类型（图 1D）。

HR 基因集特征评分显示，成纤维细胞在所有细胞类型中表达最高，基因集富集分析（GSEA）也显示 HR 基因集在成纤维细胞中显著富集，对单个基因表达的检查证实，大多数 HR 基因主要由成纤维细胞表达（图 1E、1F、1G、1H）。

综上，作者发现成纤维细胞是晚期膀胱肿瘤中与不良预后相关的 HR 基因集的主要来源。

图 2：高表达 HR 基因集的成纤维细胞群 MMP11+mCAFs 的鉴定

作者分离成纤维细胞群并将其重新聚类为八个不同的亚群，其中 MMP11+ mCAFs 表现出最高的 HR 特征评分，且 COL1A1、MMP11、POSTN、COL3A1 和 CTHRC1 等基因表达升高（图 2A、2B）。

比例分析显示，MMP11+ mCAFs 在肿瘤组织中比邻近正常组织中更为丰富，免疫荧光（IF）染色证实了 MMP11+ mCAFs 在肿瘤微环境中的主要存在（图 2C、2D）。

作者通过 CIBERSORTx 对 TCGA-BLCA 批量 RNAseq 数据进行反卷积分析，估计每个成纤维细胞亚群的丰度，发现 MMP11+ mCAFs 的比例随着肿瘤进展而逐渐增加，并且主要富集在高级别肿瘤中，在三个独立的 GEO 数据集（GSE31684、GSE48075 和 GSE13507）中也证实了类似的趋势（图 2E）。

重要的是，在所有四个数据集中，MMP11+ mCAFs 的丰度较高始终与较差的总生存率相关，而另一个成纤维细胞亚群 IGLC1+ CAFs 的比例随着肿瘤进展呈下降趋势，并与更好的预后相关，且在所有四个数据集中，MMP11+ mCAFs 与 IGLC1+ CAFs 之间存在显著的负相关（图 2F）。

对 MMP11+ mCAFs 的功能分析显示，DEGs 在与 ECM 组织、血管发育、细胞粘附、BMP 和 TGFβ1 信号反应相关的通路中显著富集，GSEA 还显示在上皮 - 间充质转化、血管生成、凝血和顶端连接形成等标志性通路中强烈富集（图 2G、2H）。

综上所述，作者鉴定出 MMP11+ mCAFs，其与肿瘤进展相关，且功能分析表明其可能在促进肿瘤血管生成中起关键作用。

图 3：MMP11+ mCAFs 通过 WNT5A-MCAM 信号轴驱动 ESM1+ tECs 的迁移

作者进行了全面的细胞间通讯分析，发现非经典 WNT（ncWNT）信号通路在 MMP11+ mCAFs 中特别活跃，WNT5A-MCAM 轴是这种活动的主要驱动因素，MMP11+ mCAFs 通过该轴对内皮细胞产生强烈影响（图 3A、3B）。

作者进一步分离内皮细胞并将其重新聚类为四个不同的簇：ACKR1+ vEC（静脉内皮细胞）、MALAT1+ VEC、ESM1+ tEC（尖端内皮细胞）和 FBLN5+ aEC（动脉内皮细胞），MCAM 主要富集在 ESM1+ tECs 中（图 3C、3D）。

对 ESM1+ tECs 的功能分析显示，其在与 ECM 重塑、血管生成、内皮细胞迁移、缺氧反应、ncWNT 信号和粘着斑相关的通路中显著富集，基因集变异分析（GSVA）显示，ESM1+ tECs 和 FBLN5aECs 都在氧化磷酸化、蛋白质分泌、脂肪生成、DNA 修复、PI3K-Akt-mTOR 信号和 TGF-β 信号通路中富集，且 ESM1+ tECs 与血管生成相关程序和 E2F 靶标活性的关联更强（图 3E、3F）。

NicheNet 分析显示，ESM1+ tECs 中的潜在靶基因富集在血管发育、内皮细胞增殖、ECM 重塑和缺氧反应等生物学过程中（图 3G）。

IF 染色显示 MMP11+ mCAFs 与内皮细胞在空间上相邻，Transwell 迁移和管形成实验表明，WNT5A 显著增强人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的迁移和管形成能力，而 WNT5A 抑制剂 Box5-TFA 则损害了这两个过程（图 3H、3I、3J、3K、3L）。

作者检查了内皮细胞中活跃的转录因子，发现 ESM1+ tECs 中 SOX18、HOX 和 ATF 家族的几个成员以及 RARG、ING4、MXD4 和 NFIC 等转录因子的活性升高，这些因子靶向 ESM1+ tECs 的特征基因，且 SOX18、NFIC 和 HOXB9 与促进细胞迁移有关（图 3M、3N）。

作者发现 MCAM 表达与这些转录因子之间存在正相关，实验验证表明，WNT5A 刺激显著上调这些基因的表达（图 3O）。

总之，作者表明 MMP11+ mCAFs 可能通过 WNT5A 信号促进 ESM1+ tECs 的迁移，从而促进血管生成。

图 4：MMP11+ mCAFs 促进 SPP1 + 巨噬细胞产生 VEGFA

作者将 TCGA-BLCA 数据集的样本分为两个不同的分子亚型，亚型 2 与亚型 1 相比，基质和免疫评分、ESTIMATE 评分、MMP11+ mCAF 特征评分和 MMP11+ mCAFs 的比例显著更高，肿瘤纯度显著更低，免疫浸润分析显示亚型 2 中巨噬细胞浸润增加（图 4A）。

作者将巨噬细胞重新聚类为五个亚群：FOLR2+ Mac、SPP1+ Mac、RGS1+ Mac、ATP5E+ Mac 和 prolif Mac，MMP11+ mCAFs 与巨噬细胞之间的最强相互作用出现在 SPP1+ Mac 亚群中，SPP1+ Mac 以及 RGS1+ Mac 和 FOLR2+ Mac 经历了 M2 极化，SPP1+ Mac 表现出最高的血管生成评分（图 4B、4C、4D）。

功能富集分析显示，SPP1+ Mac 显著参与细胞信号传导和血管发育，突出了它们在通过增强促血管生成信号促进肿瘤血管生成中的作用（图 4E、4F、4G）。

NicheNet 分析显示，MMP11+ mCAFs 通过多种信号通路影响 SPP1+ Mac，ANXA1 是细胞因子如 CCL2、CXCL2、IL1B 和 TNF 的关键调节因子，CCL2 和 CCL11 是表达最突出的配体，GO 富集分析显示靶基因参与细胞因子产生、营养反应、缺氧适应和血管生成，且鉴定出与 VEGFA 产生的正调控相关的特定 GO 术语（图 4H、4I）。

表达分析显示 VEGFA 主要在 SPP1+ Mac 中表达，VEGFA 信号主要来自 SPP1+ Mac，靶向 ESM1+ tECs，由 VEGFR1 和 VEGFR2 介导，且 VEGFA 信号与 NFIC 的表达呈正相关（图 4J、4K、4L、4M、4N）。

综上所述，作者提出 MMP11+ mCAFs 招募并激活 SPP1+ Mac 以上调 VEGFA 产生，进而影响 ESM1+ tECs 并促进血管生成。

图 5：肿瘤分泌的 BMP2 诱导 MMP11+ mCAF 特征基因的表达

作者对所有成纤维细胞群进行 RNA 速率分析，结果表明 MMP11+ mCAFs 处于分化的起始点，PAGA 分析揭示了三种分化轨迹：MMP11+ mCAFs 转变为 IGLC1+ CAFs、CXCL14 CAFs，并通过 PLA2G2A CAFs 进展为 PTGDS+ CAFs，进一步的 Slingshot、Cytotrace 和 Monocle3 分析支持 MMP11+ mCAFs 代表低分化状态（图 5A、5B）。

伪时间轨迹分析显示，MMP11+ mCAFs 在与 ECM 重塑、胶原代谢、内皮细胞增殖、BMP 结合和免疫系统调节相关的基因模块中显著富集（图 5C）。

作者构建了一个基于 MMP11+ mCAF 特征基因的基因集，反映 RNA 速度动态，确定 TGFB1、IL1B、BMP2 和 SPP1 信号为关键调节剂，进一步研究表明，BMP2 主要由上皮细胞分泌，调节肿瘤微环境中的 MMP11+ mCAFs，且 MMP11+ mCAFs 表现出相对较高的 BMP 信号受体活性（图 5D、5E、5F）。

作者将上皮细胞重新聚类为 18 个不同的簇，BMP2 主要在 Ep3 簇中表达，该簇主要来源于肿瘤，拷贝数变异（CNV）分析证实 Ep3 簇主要由肿瘤细胞组成，Ep3 细胞表现出干扰素相关基因（IFI27、IFI6）的高表达，参与抗病毒免疫反应、细胞应激、免疫调节和胆固醇稳态，被分类为干扰素相关基底样肿瘤细胞（IFNBL 肿瘤细胞）（图 5G、5H、5I）。

CellPhoneDB 分析显示 Ep3 和 MMP11+ mCAFs 之间有很强的相互作用，CellChat 分析表明，来自 Ep3 的 BMP 信号主要靶向 MMP11+ mCAFs（图 5J）。

作者分析了成纤维细胞簇中的转录因子，确定 NFE2L3、RARB、TCF12 和 ING4 为 MMP11+ mCAFs 中最特异的转录因子，CREB3L1 的活性排名很高，分析显示 CREB3L1 调节大多数 MMP11+ mCAF 特异性基因，而 NFE2L3 主要调节 WNT5A（图 5K、5L、5M）。

在 TCGA-BLCA 样本中，NFE2L3、CREB3L1 和 WNT5A 的表达与 BMP 信号受体 ACVR1 和 BMPR2 呈正相关，在 MMP11+ mCAFs 中，NFE2L3 活性与 BMP 受体表达和 WNT5A 相关，体外定量实验表明，BMP2 处理诱导转录因子 NFE2L3 和 CREB3L1 以及 MMP11+ CAFs 的几个特征基因的表达（图 5N）。

总之，作者发现 IFN-BL 肿瘤细胞可能通过 BMP 信号促进 MMP11+ mCAFs 中 CREB3L1 和 NFE2L3 的表达和活性，从而诱导 MMP11+ mCAF 特征基因的表达。

图 6：BMP2 促进小鼠肿瘤生长和血管生成

作者在 C57BL/6J 小鼠膀胱原位肿瘤模型中，用 BMP2 及其小分子抑制剂 Dorsomorphin 进行治疗，BMP2 治疗与 PBS 对照组相比，显著增加了肿瘤负荷，而抑制 BMP 信号则缓解了肿瘤进展（图 6A、6B、6C、6D）。

流式细胞术分析显示，BMP2 治疗组的血管内皮细胞显著增加，而 Dorsomorphin 治疗降低了它们的丰度（图 6E、6F）。

免疫组织化学（IHC）和 IF 分析显示，BMP2 治疗的肿瘤中 MMP11+、SPP1 + 和 CD31 + 细胞显著富集，而抑制剂治疗组则观察到相反的模式，BMP2 治疗的肿瘤中 CD31 + 内皮细胞形成更密集和复杂的血管结构（图 6G、6H）。

作者进行了条件培养基转移实验，BMP2 处理的 HBdSFs 的条件培养基显著增强 HUVEC 迁移和管形成，而抑制剂则显著抑制这些过程（图 6I、6J、6K、6L、6M）。

综上，作者的结果表明，BMP2 在小鼠膀胱癌模型中增强肿瘤生长和血管生成，可能通过诱导 WNT5A 和调节内皮细胞行为。

图 7：MMP11+ mCAFs 在各种癌症中的泛癌分析

作者对乳腺癌、胃癌、结直肠癌和肺腺癌的成纤维细胞进行降维和聚类，使用 MMP11+ mCAFs 的特征基因构建基因集进行 GSEA 分析，结果显示，MMP11+ mCAFs 在乳腺癌中主要与 FN1+ CAFs 重叠，在结直肠癌中与 COL11A1+ CAFs 重叠，在肺腺癌中与 CTHRC1+ CAFs 重叠，在胃癌中，MMP11+ mCAFs 主要与 COL11A CAFs 相关，其次与 CXCL5+ CAFs 相关（图 7A、7B、7C、7D、7E、7F、7G、7H）。

作者应用 CIBERSORT 反卷积算法估计 TCGA 数据集中 MMP11+ CAFs 的比例，分析显示，MMP11+ mCAFs 的比例在胃癌、乳腺癌和肺腺癌的不同阶段差异显著，在胃癌和结直肠癌中，MMP11+ mCAFs 的患病率随着肿瘤进展而增加，尽管结直肠癌的阶段差异没有统计学意义（图 7M）。

生存分析表明，在所有四种癌症类型中，MMP11+ mCAFs 始终与不良预后相关（图 7I、7J、7K、7L）。

总之，作者的研究结果表明，虽然 MMP11+ mCAFs 在某些癌症中与肿瘤进展相关，但它们在多种恶性肿瘤中普遍与不良临床结果相关，突出了它们作为癌症治疗中普遍治疗靶点的潜力。

本研究通过单细胞 RNA 测序鉴定出 MMP11+ mCAFs 这一与膀胱癌进展和不良预后相关的成纤维细胞亚群。该细胞群通过 WNT5A-MCAM 信号轴调节 ESM1+ tECs 的迁移，并通过招募 SPP1 + 巨噬细胞促进 VEGFA 分泌，从而促进肿瘤血管生成。机制上，干扰素相关基底样肿瘤细胞分泌的 BMP2 诱导 MMP11+ mCAFs 中 NFE2L3 和 CREB3L1 等转录因子的表达，进而促进 WNT5A 等特征基因的表达。小鼠实验证实抑制 BMP2 可抑制肿瘤血管生成和生长。泛癌分析显示 MMP11+ mCAFs 存在于多种癌症中且与不良预后相关。本研究为理解 CAFs 的异质性及其在肿瘤进展中的作用提供了新见解，为 CAF 靶向治疗提供了潜在靶点。