microRNA（miRNA）是一种约19-25个碱基、内源性、非蛋白编码和进化上高度保守的单链RNA。miRNA通过转录后基因调控的方式调节遗传信息的流动和表达，与细胞的增殖、分化、凋亡和新陈代谢等密切相关，是生命科学领域的研究热点。miRNA研究的关键在于如何准确、特异性地检测和定量miRNA。就目前而言，荧光定量PCR是应用最广的检测和定量miRNA的方法。miRNA分子较小，显然不能用传统的方法进行miRNA的提取、逆转录和qPCR，那么如何才能较好地进行miRNA的提取、逆转录和qPCR呢？
一、miRNA提取：miRNA分子较小，这么小的核酸分子很难提取。一般来说，传统的TRIzol及其它常用的RNA提取试剂盒提取的是较大分子的RNA，包括rRNA和mRNA，但对miRNA的提取效果显著不佳。这可能是因为如此小的核酸分子不易被醇类沉淀、也不易被核酸纯化膜和磁珠吸附捕捉的原因。因而，要较好地提取miRNA，必须采取一些新的思路和方法。根据目前的研究结果，miRNA富集法应该是一种不错的选择。其原理为，先使用富集试剂将含量较低、分子量较小的miRNA聚集在一起，再使用核酸纯化柱进行提取。显然，miRNA聚集后更加有利于miRNA的吸附和捕捉，从而得以有效地提升miRNA的提取得率。目前，国内有类似技术的公司不多，其中，Qiagen、BIOG miRNA富集提取试剂相对效果较好。
二、miRNA逆转录：miRNA逆转录的难点在于其分子较小，逆转录引物无法理想地与其结合。显然，要进行miRNA逆转录，就需要对miRNA分子进行加长改造。有二种方法可达至这一目的。一种采取Poly(A)加尾法，另一种采用茎环法进行加长。对于Poly(A)加尾法来说，miRNA能否有效加长的关键在于Poly(A)聚合酶的活性。Poly(A)聚合酶活性高，就可以在短时间内给miRNA加上较长的Poly(A)尾巴，使miRNA分子能够高效地结合Oligo(dT)引物。加尾法逆转录的另一个重要因素是Oligo(dT)引物的设计，如果是单纯的Oligo(dT)，引物与miRNA的结合往往会发生错位，导致逆转录效率降低。高效的Oligo(dT)引物应该加入锚定碱基，从而使二者的结合更加特异高效。茎环法逆转录成功的关键在于茎环的设计，该茎环应能高效地与miRNA 3’端特异、高效地结合，同时还要能够顺利地折叠和打开。对于从事较多miRNA（3个以上）研究的研究者来说，选用加尾法逆转录试剂较好，因为一次逆转录可以进行多个miRNA的qPCR扩增，省去了很多的实验麻烦。但对于只检测1-2个miRNA的研究者来说，选用茎环法比较合适，因为茎环法逆转录结果更加特异。目前，国内生产茎环法逆转录试剂盒的公司较多，生产加尾法逆转录试剂的公司相对较少，因为高效的Poly(A)聚合酶不易生产纯化，主要的加尾法逆转录试剂主要有Thermo、Taraka和BIOG百代等。
三、miRNA qPCR：miRNA qPCR 相对较为简单，如果miRNA能够得到高效提取，miRNA qPCR逆转录成功，miRNA qPCR一般都会有较为理想的结果。需要特别注意的是，miRNA 逆转录试剂盒和miRNA qPCR试剂盒一般是配套的，研究者最好买同一公司配套的miRNA 逆转录试剂和qPCR试剂，否则，有可能出现失败的实验结果。其主要原因是逆转录引物上往往设计有PCR引物结合序列，如果买不同厂家的试剂，PCR引物可能无法特异地结合逆转录产物。还有，对于初学者而言，miRNA上游引物的设计有一定难度，往往既花了时间，又拿不到好的实验结果，建议最好购买能够赠送上游引物的逆转录试剂生产厂家。
