作者，Evil Genius
最近其实接触了很多公司的分析人员，有一些人可能正在经历人生低谷，可是越是人生低谷，越要坚持。
其实我是不相信，自己有工作有存款的时候去买盗版，来到人生低谷的时候非要追求正版的。
今天我们复习文献，非常重要
知识积累
癌症相关成纤维细胞（CAFs）是一类多功能的细胞群，对塑造肿瘤微环境（TME）和影响治疗反应具有关键作用。
整合分析来自7种空间转录组与蛋白质组平台、10种癌症类型的超1400万个细胞，鉴定、验证并表征了四种具有空间特异性的CAF亚型。这些亚型在不同癌种间具有保守性，且不受空间组学平台影响。值得注意的是，它们展现出独特的空间分布模式、邻近细胞组成、互作网络和转录特征。其丰度与组成在不同组织间存在差异，进而塑造了TME特征——包括肿瘤浸润免疫细胞的水平、分布与状态组成，肿瘤免疫表型以及患者生存预后。
运用的技术平台
结果1、四种空间CAF亚型的鉴定
经批次校正后，无监督聚类在CosMx和MERSCOPE数据集中分别鉴定出100,272个和469,249个CAFs，同时识别出B细胞、T细胞、浆细胞、肥大细胞、树突细胞、内皮细胞、巨噬细胞及中性粒细胞等其他TME细胞。
计算了每个CAF周围80μm半径范围内的细胞组成（即"邻域向量"），通过非负矩阵分解（NMF）进行空间模式提取，最终鉴定出四种空间特征迥异的CAF亚型：s1-CAFs、s2-CAFs、s3-CAFs和s4-CAFs（依据微环境划分细胞亚群）。各CAF亚型展现出独特的空间分布模式、邻近细胞组成及互作网络。
结果2、空间CAF亚型的转录组特征及其邻域细胞互作分析
对空间CAF亚型的转录状态进行了系统表征
- s1-CAFs 高表达与ECM重塑相关的经典胶原基因（COL1A1、COL3A1和COL4A1），以及平滑肌收缩相关基因（ACTA2、TPM2、MYH11、TAGLN和MYL9）。该亚型还表现出基质金属蛋白酶（MMP7和MMP14）与细胞因子（TGFB1和CXCL8）的高表达，符合myCAFs的特征。
- s2-CAFs 虽表达胶原基因但ACTA2、TPM2、TGFB1、CXCL8和MMPs水平较低，同时显著高表达炎症因子LIF和IL6，这些因子是TME中炎症与免疫抑制的关键介质。尽管FAP仅存在于MERSCOPE检测panel中，s2-CAFs显示出与既往报道的FAP+αSMA+ CAFs相似的特征。
- s3-CAFs 呈现生长因子受体（PDGFRA和PDGFRB）、MMP2、MT1X、应激反应基因（HSPA1A和HSPA1B）、CXCL14及补体成分（CFD、C1QA和C1QC）的高表达，同时保留COL4A1、TPM2和抗原呈递基因（CD74、TAP2、HLA II类分子）。虽然部分特征与iCAFs（如CXCL14和CFD）及apCAFs（如抗原呈递基因）重叠，但其独特的生长因子受体表达和应激反应特征使其区别于经典亚型。
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s4-CAFs 的STAT3、趋化因子（CXCL9、CCL2、CCL19和CCL21）及抗原呈递基因表达最为显著（图1D-1F）。尽管在趋化因子表达上与iCAFs有相似性，但因兼具抗原呈递基因和免疫调节细胞因子特征，更接近apCAFs表型。
通过配体-受体互作分析各空间CAF亚型的细胞通讯网络，观察到独特的互作模式
- s1-CAFs 主要与癌细胞通过ECM成分（I/IV/VI/IX型胶原和纤连蛋白FN1）互作，癌细胞则表达整合素受体（α1β1、α2β1和αvβ6）。此外，s1-CAFs通过THBS1-CD47（免疫逃逸）、TGFB1-TGFBR1（促肿瘤转移）及FGF2-FGFR1（促血管生成）等通路与癌细胞相互作用。
- s2-CAFs主要与基质中的内皮细胞和T细胞通讯，通过ECM成分-整合素（ITGA9/ITGB1）与内皮细胞互作，并通过CD55-ADGRE5（CD97）调控T细胞迁移与应答。
- s3-CAFs与髓系细胞的特异性互作尤为突出：与巨噬细胞通过RARRES2-CMKLR1（迁移调控）、GAS6-MERTK（免疫抑制表型诱导）、DLL1-NOTCH3（极化调控）及LGALS9-MRC2（免疫逃逸）等通路互作；与中性粒细胞通过CXCL12-CXCR4（浸润促进）、ANXA1-FPR1（功能调控）及APP-CD74（免疫应答调节）等机制相互作用。
- s4-CAFs 在淋巴聚集区（LAs/TLSs）中与B/T/浆细胞频繁互作：通过CCL19/CCL21-CCR7招募淋巴细胞，参与TLS形成；经VCAN-SELL调控T细胞迁移，通过AXL-IL15RA影响T细胞增殖；与B细胞通过JAG1-NOTCH2和LGALS9-CD47互作支持其分化；与浆细胞通过胶原-CD44（黏附调控）及JAG1-NOTCH3（分化调控）维持浆细胞微环境。
结果3、CAF邻域内的免疫细胞状态与空间分布模式
进一步分析了CosMx数据集中不同CAF邻域内主要免疫细胞（包括T细胞、巨噬细胞、B细胞和浆细胞）的状态与组成特征。
不同CAF邻域的T细胞组成差异显著
- s1-CAF邻域：Treg（CD4+）、Teff（CD8+）和Tex（CD8+）比例分别比其他区域高2.1倍、1.5倍和1.6倍。该区域T细胞高表达Treg相关受体TNFRSF18（GITR），且CD8+ Teff细胞显著表达细胞毒性基因（GNLY和PRF1）。
- s2/s3-CAF邻域：Tstr细胞比例分别增加2.1倍和2.9倍，其中s3-CAF邻域占比最高。
- s4-CAF邻域：Tn细胞与Tfh（CD4+）比例最高，其特征性标志物CCR7和CXCR5表达显著；同时CCR7+SELL+共表达的Tcm（CD4+）细胞也明显富集。
巨噬细胞的表达谱在不同CAF邻域中同样呈现差异：
- s1-CAF邻域：巨噬细胞高表达IL15RA和IL32
- s3-CAF邻域：显著上调CCR1、CCL18、CCL3L3、CCL3等趋化因子），以及CD163、CD209、ARG1等M2型标志物。其中CCL18（促M2极化）与肿瘤进展相关，CCR1促进巨噬细胞迁移，CCL3/CCL3L3参与免疫细胞招募。
B细胞与浆细胞的空间分布模式具有显著异质性：
- B细胞：主要富集于s4-CAF邻域，与s4-CAFs互作强度最高
- 浆细胞：存在于所有CAF邻域，且是距离CAFs最近的细胞类型（仅次于内皮细胞）。其空间分布特征包括：
- s1-CAF邻域：CAFs形成致密"屏障"阻隔浆细胞与肿瘤细胞接触
- s2-CAF邻域：浆细胞与CAFs在基质微环境中紧密共定位
- s4-CAF邻域：浆细胞与CAFs共定位于TLSs外层，可能介导浆细胞向肿瘤组织的迁移
这些发现揭示了CAFs通过空间特异性方式调控免疫细胞分布与功能的多样性机制。
结果4、CAFs在多种癌症中的保守空间亚型与细胞邻域结构
通过多平台独立数据集验证这四种空间CAF亚型在非小细胞肺癌（NSCLC）外的其他癌种中的普适性。
MERSCOPE数据集中四种CAF亚型的差异表达基因（DEGs）与CosMx数据集高度一致。
为验证该方法在spot级空间转录组（ST）数据中的适用性，分析了LUAD和胰腺癌（PDAC）的Visium数据。通过RCTD细胞类型反卷积和邻域向量聚类，在LUAD样本中成功识别出四种CAF亚型，其空间分布模式与原位特征吻合。使用iStar算法基于预设基因集进行区域推断的结果与病理医师标注高度一致，共定位分析显示：与癌细胞共区域的CAFs对应s1-CAFs，与巨噬细胞共区域的对应s3-CAFs，位于淋巴聚集区的则对应s4-CAFs。PDAC样本中主要重现了s1/s3-CAFs的分布特征。
结果5、空间多组学数据揭示CAF亚型对T细胞浸润与分布的调控作用
为探究空间CAF亚型对肿瘤微环境（TME）的调控作用，我们根据肿瘤细胞分布将组织切片划分为三个区域：
- 肿瘤核心区：完全或主要由肿瘤细胞组成的区域
- 肿瘤边缘区：距离肿瘤核心100μm范围内的过渡带
- 远端基质区：距肿瘤核心100μm以上且无肿瘤细胞的区域
通过计算各区域CAF亚型占比与T细胞浸润水平，发现：
- s1-CAFs高占比样本：肿瘤核心与边缘区T细胞浸润显著降低，而远端基质区T细胞相对富集
- s3-CAFs：与多种T细胞状态（尤其是远端区）呈强正相关，但在肿瘤核心区呈微弱负相关
- s4-CAFs：在肿瘤边缘/核心区与免疫细胞（特别是T/B细胞）浸润显著正相关
进一步对CosMx和MERSCOPE数据集的24个样本进行免疫细胞亚群相关性分析，结果显示：
- s1-CAFs：与大多数T细胞状态（包括初始样、效应及耗竭T细胞）及其他免疫细胞在肿瘤核心/边缘区呈显著负相关。
- s3-CAFs：在远端区与髓系细胞及应激反应T细胞（Tstr）高度正相关,在肿瘤核心区与CD8+ Tex细胞负相关。
- s4-CAFs：在肿瘤边缘区与滤泡辅助性T细胞（Tfh）和中央记忆T细胞（Tcm）正相关；在核心区与浆细胞浸润显著相关。
这些发现提示CAF空间亚型通过区域特异性方式调控免疫细胞分布：s1-CAFs可能限制免疫细胞向肿瘤实质的浸润，s3-CAFs在远端基质促进免疫细胞聚集，而s4-CAFs则支持肿瘤内免疫微环境形成。
结果6、基于Xenium 5K平台的空间CAF亚型验证及其对T细胞浸润的调控作用
采用Xenium Prime 5K Panel（10x Genomics）进行跨平台验证。
通过NMF聚类仍成功鉴定出四种空间CAF亚型。其表达谱与邻域细胞组成与CosMx/MERSCOPE数据集定义的特征一致，证实了空间邻域分析方法的鲁棒性。值得注意的是，尽管不同Panel基因覆盖度各异，但均包含识别主要细胞类型的必需标记，支持通过CAF邻域组成定量和NMF聚类来解析空间组织模式。
利用Xenium 5K增强的癌症相关基因覆盖度，进一步探究了癌细胞状态、CAF亚型-癌细胞互作及其对T细胞浸润的影响。通过无监督聚类在卵巢癌样本（Ovarian xe1）中鉴定出三种具有空间分布异质性的癌细胞状态：
- 状态1：高表达免疫逃逸相关基因（CD47、CD44、CCL28、NT5E），与s1-CAFs共定位且T细胞浸润低
- 状态2：高增殖（TERT/ALK）和应激反应（SESN3）特征，T细胞浸润最高
- 状态3：促血管生成（S1PR3）和血管完整性（TMEM100）特征，因肿瘤高度聚集导致s1-CAFs和T细胞减少
在s1-CAFs邻近区域，状态1癌细胞富集度达61.4%（vs 远端区15.4%）。跨癌种分析发现，s1-CAFs邻近区域存在55个共同上调基因（如CD47、PDCD1LG2、CXCL12），其中7个基因（如IFITM1）在全部4个样本中一致上调。这些基因中CD47（免疫检查点配体）、PDCD1LG2（PD-L2）和CXCL12均为已知的免疫排斥介质。在基因覆盖度最高的Ovarian xe1样本中，细胞通讯分析显示s1-CAFs与癌细胞通过THBS1-CD47（通讯概率最高）和CXCL12-CXCR4等通路互作，揭示了CAF-癌细胞空间互作促进免疫逃逸的潜在机制。
结果7、基于COMET技术的空间CAF亚型及组织结构模式验证
COMET检测结果在LUAD和PDAC中均验证了四种空间CAF亚型及其邻域细胞组织模式的存在。研究发现s1-CAFs与s2-CAFs、s1-CAFs与s4-CAFs等亚型存在空间毗邻现象，揭示了CAF亚型间复杂的空间关系。
COMET技术揭示了各CAF亚型独特的形态学特征：
- s1-CAFs：定位于肿瘤区域，沿肿瘤边界呈"袖套样"分布，提示其可能调控肿瘤-基质界面互作
- s2-CAFs：呈现高FAP表达的致密形态，深部基质分布，常与巨噬细胞/T细胞等免疫细胞交织，可能参与基质重塑与免疫调节
- s3-CAFs：以稀疏分散形式富集于髓系细胞微环境，高表达PDGFRB，暗示与髓系细胞的广泛互作
- s4-CAFs：与B/T细胞cluster及TLSs等免疫结构网络状交织，可能协调局部免疫应答
这些发现凸显了CAFs在空间组织上的异质性——不同亚型通过独特的分布模式与形态特征，在肿瘤生物学和免疫调控中发挥差异化功能。
结果8、基于CODEX与IMC技术的空间CAF亚型验证及临床关联性分析
为探究空间CAF亚型的临床意义，分析了CODEX和IMC两个公共数据集。
CODEX数据集包含35例结直肠癌（CRC）患者的70个组织芯片（TMA）样本，采用56-plex抗体panel检测。分析验证了四种空间CAF亚型的存在及其邻域细胞组织模式和表达特征。比较两组患者："克罗恩样反应"组（CLR，肿瘤浸润前沿存在新生TLSs）与"弥漫炎症浸润"组（DII，无TLSs）显示：
- s4-CAFs：CLR组比例显著高于DII组（9% vs 2%，p=0.064），与TLSs的空间定位一致
- s1-CAFs：CLR组比例低于DII组（26% vs 41%）
生存分析表明，高s1-CAFs水平与较短生存期相关（p=0.091），而高s4-CAFs水平显著延长生存。s1-CAFs低/s4-CAFs高的患者预后最佳（vs其他患者p=0.0097；vs双低组p=0.0019），提示CAF空间亚型可作为预后标志物。
在包含1,070例NSCLC患者的IMC数据集中（618例LUAD，401例LUSC），通过2,070个TMA核心的45种金属标记抗体检测，NMF聚类再次验证了四种CAF亚型。该研究原定义的11种分子CAF亚型与原先分析的空间亚型存在显著重叠：
- s1-CAFs：与mCAFs（MMP11+αSMA+胶原+）和SMA CAFs高度重合，符合myCAF特征
- s2-CAFs：包含PDPN CAFs、胶原CAFs及缺氧型tCAFs，提示ECM重塑功能
- s3-CAFs：与iCAFs（CD34+CD248+）和缺氧CAFs一致，反映炎症/缺氧特性
- s4-CAFs：覆盖dCAFs（Ki-67+）、infCAFs（IDO+）和vCAFs（CD146+），其高HLA-DR表达暗示抗原呈递功能
进一步分析显示：
- 亚型分布差异：LUAD与LUSC的CAF亚型组成不同，各亚型邻域内T细胞状态异质性显著
- 临床分期关联：CAF亚型丰度随病理分期变化
- 生存预后价值：s3-CAFs（尤其LUSC）和s4-CAFs（整体NSCLC）与更长生存期显著相关；根据CAF亚型组成将患者分为四组，G1（s1-CAFs主导）预后最差，G4（s4-CAFs富集）最佳，G2-G3居中且癌型特异性明显
这些发现证实空间CAF亚型的组成特征可作为NSCLC的独立预后因素。
总结一下
预后价值提示：
- s1-CAFs主导型患者预后最差
- s4-CAFs富集型患者生存最佳
空间组学与转录组定义的CAF亚型存在显著重叠，但二者关系仍需全转录组测序进一步验证。CAFs通过复杂互作网络塑造免疫微环境：
- s1-CAFs：通过THBS1-CD47等互作促进免疫逃逸
- s3-CAFs：经GAS6-MERTK等通路调控巨噬细胞免疫抑制表型
- s4-CAFs：通过JAG1-NOTCH维持B细胞分化微环境
这些发现强调：
- 空间关系的重要性：细胞互作具有精确的空间调控特征
- 治疗策略启示：靶向CAF亚型特异性互作网络（如阻断s1-CAFs的THBS1-CD47轴）
最后来看看一些关键的方法
高精度空转分析
Visium数据分析
空间CAFs亚型的识别
细胞通讯
空间距离分析
