继前文：
https://www.jianshu.com/p/49569e3e56db?v=1667952653813
一、samtools
samtools是一个用于操作sam和bam文件的工具合集。
（1）安装
网站地址：
https://sourceforge.net/projects/samtools/files/samtools/
下载需要的版本，我选择下载最新版。
复制的链接是：
https://sourceforge.net/projects/samtools/files/samtools/1.16/samtools-1.16.1.tar.bz2/download
通常下载后得到的是一个download文件，这时候将download删掉就好了，即https://sourceforge.net/projects/samtools/files/samtools/1.16/samtools-1.16.1.tar.bz2
下载命令如下：
wget https://sourceforge.net/projects/samtools/files/samtools/1.16/samtools-1.16.1.tar.bz2
注意这里是bz格式的压缩文件
tar jxvf samtools-1.16.1.tar.bz2
cd samtools-1.16.1
注意这里的configure文件。
然后再输入命令：
./configure --prefix=~/samtools-1.16.1
出现错误：
这里应该用绝对路径，而我用的是相对路径。
于是输入：
pwd 显示绝对路径
./configure --prefix=/home/ylx/Biosofts/samtools-1.16.1
出现错误：
输入：
sudo apt install build-essential
sudo apt install gcc
出现错误：
输入：
apt-get install libncurses5-dev
出现错误：
输入：
apt install zlib1g
出现错误：
输入：
apt install libbz2-dev
出现错误：
输入：
apt install libbz2-dev
出现警告：
输入：
apt-get install libcurl4-openssl-dev
出现警告：
输入：
apt-get install apache2
apt-get install libssl-dev
然后再输入：
make 进行源代码编译
make install 源代码编译后进行安装
./samtools --help 检验是否安装成功
vi ../.bashrc
export PATH=~/samtools-1.16.1:$PATH 将这一条命令添加到.bashrc文件的末尾
source ../.bashrc
cd ~
samtools --help检验环境是否添加成功
（2）用法
1.为参考基因组建立索引，生成了prefix.fai文件
命令如下：
samtools faidx GCA_000817325.1_ASM81732
生成GCA_000817325.1_ASM81732v1_genomic.fna.fai文件
faidx ：对fasta文件建立索引,生成的索引文件以.fai后缀结尾。该命令也能依据索引文件快速提取fasta文件中的某一条（子）序列
2.SAM格式转为BAM格式
命令如下：
samtools view -bhS -t GCA_000817325.1_ASM81732v1_genomic.fna.fai -o test_7942_bwa.bam test_7942_bwa.sam
生成文件test_7942_bwa.bam。
命令解释：
Usage: samtoolsview [options] <in.bam>|<in.sam> [region1 [...]]
默认情况下不加region，则是输出所有的region. Options:
-b output BAM 默认下输出是SAM 格式文件，该参数设置输出BAM 格式
-h print header for the SAM output 默认下输出的sam格式文件不带header，该参数设定输出sam文件时带header 信息
-H print header only (no alignments) 仅仅输出文件的头文件
-S input is SAM 默认下输入是BAM 文件，若是输入是SAM 文件，则最好加该参数，否则有时候会报错。
-u uncompressed BAM output (force -b) 该参数的使用需要有-b参数，能节约时间，但是需要更多磁盘空间。
-c 不输出匹配记录，只输出匹配记录的计数
-L 仅包括和bed文件存在overlap的reads
-X output FLAG in string (samtools-C specific)
-t FILE list of reference names and lengths (force -S) [null] 使用一个list文件来作为header的输入
-T FILE reference sequence file (force -S) [null] 使用序列fasta文件作为header的输入
-o FILE output file name [stdout] 输出文件的名称
-R FILE list of read groups to be outputted [null]
-f INT required flag, 0 for unset [0] -F INT filtering flag, 0 for unset [0] Skip alignments with bits present in INT [0] 数字4代表该序列没有比对到参考序列上，数字8代表该序列的mate序列没有比对到参考序列上
3.为bam文件排序
命令如下：
samtools sort test_7942_bwa.bam -o test_7942_bwa.bam.sorted
为bam文件排序，sort只能为bam文件排序，而不能为sam。不同版本samtoolssort命令的-o参数不同。
4.为排序的bam文件建立索引
命令如下：
samtools index test_7942_bwa.bam.sorted
生成test_7942_bwa.bam.sorted.bai文件。
5.统计比对结果
samtools depth test_7942_bwa.bam.sorted > depth.txt
less depth.txt
samtools depth测试参考基因组每个位点或一段区域的测序深度（不是常说的平均测序深度）并输出到标准输出。输入的bam文件必须先做samtools index。
然后再执行命令：
samtools flagstat test_7942_bwa.bam.sorted
给出BAM文件的比对结果，并输出比对统计结果。除了-@参数指定线程，没有其他的参数。
结果：
结果解读：
200126 + 0 in total (QC-passed reads + QC-failed reads) :总共的reads数
0 + 0 secondary
126 + 0 supplementary
0 + 0 duplicates
198223 + 0 mapped (99.05% : N/A) :总体上reads的匹配率
200000 + 0 paired in sequencing :有多少reads是属于paired reads
100000 + 0 read1 :reads1中的reads数
100000 + 0 read2 :reads2中的reads数
195878 + 0 properly paired (97.94% : N/A) :完美匹配的reads数和比例：比对到同一条参考序列，并且两条reads之间的距离符合设置的阈值
197918 + 0 with itself and mate mapped :paired reads中两条都比对到参考序列上的reads数
179 + 0 singletons (0.09% : N/A) :单独一条匹配到参考序列上的reads数，和上一个相加，则是总的匹配上的reads数
2 + 0 with mate mapped to a different chr :paired reads中两条分别比对到两条不同的参考序列的reads数
2 + 0 with mate mapped to a different chr (mapQ>=5) :同上一个，只是其中比对质量>=5的reads的数量
6.查看比对结果
samtools tview test_7942_bwa.bam.sorted GCA_000817325.1_ASM81732v1_genomic.fna
tview能直观的显示出reads比对基因组的情况，和基因组浏览器有点类似。可视化一般用IGV比较好。
使用H(左）J（上）K（下）L（右）移动显示界面。大写字母移动快，小写字母移动慢。使用空格建向左快速移动（和 L 类似），使用Backspace键向左快速移动（和 H 类似）。
Ctrl+H 向左移动1kb碱基距离； Ctrl+L 向右移动1kb碱基距离。
可以用颜色标注比对质量，碱基质量，核苷酸等。30～40的碱基质量或比对质量使用白色表示。
20～30黄色；10～20绿色；0～10蓝色。
使用点号切换显示碱基和点号；使用r切换显示read name等
还有很多其它的使用说明，具体按 ？ 键来查看。
输入g，会出现如图Goto:，然后再输入染色体名称和想查看序列的位置。
7.将BAM格式文件转为BCF文件
samtools mpileup -f GCA_000817325.1_ASM81732v1_genomic.fna test_7942_bwa.bam.sorted > bcf.txt
less bcf.txt
结果：
samtools mpileup -gf GCA_000817325.1_ASM81732v1_genomic.fna test_7942_bwa.bam.sorted > test_PCC7942_bwa.bcf
less test_PCC7942_bwa.bcf
生成的test_PCC7942_bwa.bcf是一个二进制文件。
mpileup，以前为pileup也是samtools非常重要的命令。该命令用于生成bcf文件，再使用bcftools进行SNP和Indel的分析。bcftools是samtool中附带的软件，在samtools的安装文件夹中可以找到。
最常用的参数有2：
-f 输入有索引文件的fasta参考序列。
-g 输出到bcf格式。
mpileup不使用-u或-g参数时，则不生成二进制的bcf文件，而生成一个文本文件(输出到标准输出)。该文本文件统计了参考序列中每个碱基位点的比对情况；该文件每一行代表了参考序列中某一个碱基位点的比对结果。
txt文件解读：
一共有六列，分别是参考序列名，位置，参考碱基，比对上的reads数，比对情况，比对上的碱基的质量。其中第五列比较复杂，详细解读第五列。
. :代表与参考序列正链匹配。
, :代表与参考序列负链匹配。
A/T/C/G/N代表在正链上的不匹配。
a/t/c/g/n代表在负链上的不匹配。
* :代表模糊碱基。
^ :代表匹配的碱基是一个read的开始。后面紧跟的ascii码减去33代表比对质量。这两个符号修饰的是后面的碱基，其后紧跟的碱基(.,ATCGatcgNn)代表该read的第一个碱基。
$ :代表一个read的结束，该符号修饰的是其前面的碱基。
正则式'+[0-9]+[ACGTNacgtn]+'代表在该位点后插入的碱基.比如上例中在scaffold_1的2847后插入了9个长度的碱基acggtgaag。表明此处极可能是indel。
正则式’-[0-9]+[ACGTNacgtn]+’代表在该位点后缺失的碱基。
详细参考文章：
https://www.jianshu.com/p/6b7a442d293f
二、picard
后续更新。
