01文章信息
发表杂志名称：Journal of Translational Medicine
中文标题：多组学整合和机器学习揭示胰腺癌的分子基底样亚型并表明 A2ML1 在促进肿瘤上皮 - 间质转化中的作用
英文标题：Multi-omics integration and machine learning uncover molecular basal-like subtype of pancreatic cancer and implicate A2ML1 in promoting tumor epithelial-mesenchymal transition
影响因子：7.5
发表日期：2025 年 7 月 4 日
01研究概述
胰腺癌（PC）具有高度异质性且预后较差，精确的分子分型有助于深入理解疾病进展。本研究整合了 168 个 PC 样本的转录组、甲基化和突变数据，采用 10 种分类方法在 13 个独立队列中建立并验证了分子亚型；通过多种机器学习方法识别预后基因并构建预测模型，重点探究了关键基因 A2ML1 的功能及机制。结果显示，PC 可分为两个预后不同的分子亚型，通路富集分析揭示了亚型特异性特征；基于 23 个预后基因，利用 101 种机器学习算法及组合构建的预后模型中，岭回归表现最优，且该模型准确性优于多个已发表模型，其风险评分与药物敏感性、临床特征及患者结局显著相关；A2ML1 在 PC 组织中高表达，通过下调 LZTR1 表达激活 KRAS/MAPK 通路，最终驱动上皮 - 间质转化（EMT）以促进 PC 进展。综上，本研究发现了 PC 的分子基底样亚型，建立了基于岭回归的预后模型，并证实 A2ML1 是 PC 进展中 EMT 的关键调控因子。
01研究结果
图 1：TCGA-PAAD 队列的胰腺癌样本可分为 CS1 和 CS2 两个亚型
作者通过 CAP 和 Gap-statistics 方法综合评估，确定最佳聚类数为 2（图 1A）；热图展示了两个分子亚型在 mRNA、miRNA、lncRNA、DNA 甲基化位点和突变基因中的多组学特征，突出了每个组学类别中前 10 个最具变异性的特征（图 1B）；轮廓图显示两个分子亚型的聚类效果良好（图 1C）；整合 10 种不同分类方法的分型结果，确定了每个样本的分子亚型（图 1D）；共识热图清晰展示了两个分子亚型的独特特征（图 1E）；Kaplan-Meier 曲线显示，CS1 在所有时间点的预后均显著差于 CS2（P<0.001，图 1F）。综上，TCGA-PAAD 队列的胰腺癌样本可明确分为 CS1 和 CS2 两个分子亚型，且两者预后差异显著。
图 2：两个亚型在免疫浸润、通路富集和免疫相关基因表达上存在显著差异
作者通过多种计算算法评估免疫细胞浸润，发现 CS1 和 CS2 在中性粒细胞、巨噬细胞、髓系树突状细胞和调节性 T 细胞等多种免疫细胞的浸润上存在显著差异（图 2A）；GSEA 分析显示，CS1 的差异表达基因（DEGs）显著富集于免疫相关生物学过程（如抗菌体液免疫反应、中性粒细胞迁移）和 EMT 相关过程（如角质化、表皮发育调控），而 CS2 则富集于代谢相关过程（如 mRNA 核输出、谷氨酸受体信号通路）（图 2B）；GSVA 分析揭示，两个亚型在免疫相关过程基因集（图 2C）和 hallmark 基因集（如凋亡、EMT、缺氧、KRAS 信号）（图 2D）的富集水平上存在显著差异；此外，CS1 中大多数免疫调节剂（图 2E）和免疫检查点（如 CTLA4、CD276）（图 2F）的表达显著低于 CS2。综上，两个分子亚型在免疫浸润模式、通路富集特征及免疫相关基因表达上具有显著差异。
图 3：分子分型在外部队列中稳健且与临床特征和其他分型相关
作者利用 12 个外部胰腺癌队列验证分子亚型的有效性，通过 NTP 方法预测样本亚型后，Kaplan-Meier 分析显示，除 GSE28735 队列外，多个队列（如 E-MTAB-6134、GSE21501 等）中 CS2 的预后均显著优于 CS1（P<0.05，图 3A-E 及补充图 1A-F）；比较临床特征发现，与 CS2 相比，CS1 表现出更晚期的肿瘤分期和更高的组织学分级（P<0.05，图 3G-J）；与既往分型系统比较，CS1 主要与免疫 C2 和 C6 特征相关，而 CS2 富集免疫 C3 特征（图 3K），且 CS1 富集基质激活和纯基底样亚型，CS2 则倾向于纯经典和免疫经典亚型（图 3L）。综上，该分子分型在多个外部队列中具有稳健性，且与临床特征及其他已建立的分型系统存在显著关联。
图 4：基于岭回归的预后模型表现最佳且能有效区分高低风险组
作者在训练集（E-MTAB-6134）中使用 101 种机器学习算法组合构建预后模型，并在 12 个独立验证队列中验证，发现岭回归在所有算法组合中平均 C 指数最高（图 4A）；确定了最小部分似然偏差下的最佳 λ 值及相应变量系数（图 4B）；对 23 个候选基因进行单变量 Cox 回归分析（图 4C 及补充图 2A-L）；在岭回归模型中，计算每个样本的风险评分并以最佳阈值将其分为高风险和低风险组（图 4D 及补充图 3A-L）；除 GSE21501 队列外，所有数据集的高风险组预后均显著差于低风险组（P<0.05，图 4E 及补充图 4A-L）。综上，基于岭回归的预后模型表现最优，可有效将患者分为不同预后风险组。
图 5：本研究的预后 signature 预测性能优于既往模型
作者通过系统文献综述收集了 172 个已发表的胰腺癌预后 signature，在多个独立队列（如 E-MTAB-6134、GSE21501、GSE28735 等）中比较发现，本研究的 signature 在所有队列中均保持顶级 C 指数排名（图 5A-G 及补充图 5A-F）。综上，本研究开发的预后 signature 的预测稳定性和准确性优于既往已发表的模型。
图 6：整合 signature 和临床变量的预后模型具有高准确性
作者比较发现，在所有评估队列中，该 signature 的预后准确性均优于患者年龄、肿瘤分期、组织分化等级和治疗方式等临床变量（图 6A-E）；利用 TCGA-PAAD 队列的临床数据，通过单变量和多变量 Cox 回归分析，将年龄、肿瘤分级、化疗状态和风险评分纳入最终预后模型（图 6F-G）；该模型以动态列线图和在线计算器形式实现（图 6H），校准曲线和决策曲线分析（DCA）显示其预测性能稳健（图 6I-J）；ROC 曲线显示，该模型预测总生存期（OS）的 1 年 AUC 为 0.82，2-3 年 AUC 为 0.79（图 6K）。综上，整合预后 signature 和临床变量的模型具有较高的预测准确性，可有效评估患者预后。
图 7：风险评分与通路富集、药物敏感性和临床特征相关
作者对高低风险组的 DEGs 进行 GSEA 分析，发现低风险组显著富集代谢通路（如 GABA 能突触、蛋白质输出），高风险组则富集免疫相关疾病通路（如哮喘、自身免疫性甲状腺疾病）（图 7A）；药物敏感性分析显示，高风险组对 AICAR、博来霉素等药物更敏感，低风险组对阿西替尼、埃勒斯克洛莫尔等更敏感（均 P<0.001，图 7B）；风险评分与肿瘤突变负荷（TMB）无显著相关性（P>0.05，图 7C）；此外，风险评分与肿瘤分级（G3/4>G2>G1）、切除边缘状态（R1>R0）、组织学分类（基底样 > 经典）均显著相关（均 P<0.05，图 7D-F）。综上，风险评分与通路富集模式、药物敏感性及多项临床特征密切相关。
图 8：单细胞分析显示 A2ML1 在特定细胞类型中高表达
作者对 8 个独立队列的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据进行分析，经降维、聚类和细胞类型注释后发现，FAM83A 和 A2ML1 主要在上皮细胞、导管细胞和恶性细胞群体中高表达（图 8A-D 及补充图 6A-D）。综上，单细胞水平分析表明 A2ML1 在胰腺癌的特定细胞类型中高表达。
图 9：A2ML1 在肿瘤组织中高表达且有特定定位
作者通过空间转录组分析 GSE272362 数据集，发现 A2ML1 在胰腺癌标本中的表达谱和组织定位具有特异性；与正常胰腺组织相比，肿瘤组织（包括原发灶、淋巴结转移灶和肝转移灶）中 A2ML1 阳性细胞的比例显著升高（图 9A-D）。综上，空间转录组分析证实 A2ML1 在胰腺癌组织（包括原发和转移灶）中高表达。
图 10：A2ML1 在胰腺癌中高表达且促进肿瘤细胞增殖
作者通过 RT-qPCR、western blotting 和免疫组化（IHC）验证发现，A2ML1 在 5 对胰腺癌及癌旁正常组织中显著高表达（图 10A-C）；在细胞系中，A2ML1 在 4 种胰腺癌细朐系（T3M-4、PANC-1 等）中的表达显著高于正常胰腺导管上皮细胞系 H6C7（图 10D-E）；通过 RNA 干扰沉默 T3M-4 细胞中的 A2ML1（图 10F），或通过慢病毒转导在 PANC-1 细胞中过表达 A2ML1（图 10G）后，CCK-8（图 10H）和集落形成实验（图 10I）显示，A2ML1 敲低显著抑制细胞增殖，而过表达则促进增殖。综上，A2ML1 在胰腺癌组织和细胞系中高表达，且能促进肿瘤细胞增殖。
图 11：A2ML1 促进胰腺癌细朐迁移、侵袭，抑制凋亡，影响细胞周期和 EMT
作者通过伤口愈合实验（图 11A）和 Transwell 迁移实验（图 11B）发现，A2ML1 敲低显著抑制 T3M-4 细胞迁移，过表达则促进 PANC-1 细胞迁移；Transwell 侵袭实验显示类似结果（图 11C）；Western blotting 检测 EMT 标志物发现，A2ML1 敲低减少 N - 钙粘蛋白、波形蛋白和 Snail 的表达，增加 E - 钙粘蛋白水平，过表达则呈现相反效果（图 11D）；流式细胞术显示，A2ML1 敲低促进细胞凋亡（图 11E），并诱导 G1 期细胞周期阻滞（图 11F）。综上，A2ML1 可促进胰腺癌细朐的迁移、侵袭和 EMT，抑制凋亡，并影响细胞周期进程。
图 12：A2ML1 在类器官中诱导 EMT 并与 LZTR1 相互作用
作者利用患者来源的类器官模型，发现胰腺癌类器官有腺状和实性两种形态（图 12A），TGF-β1 处理可诱导 EMT 形态转变，而 A2ML1 过表达也能诱导类似的间质转化（图 12B）；免疫荧光分析显示，A2ML1 过表达的类器官中 E - 钙粘蛋白减少、波形蛋白增加（图 12C）；通过生物信息学预测和 Co-IP 实验，证实 A2ML1 与 LZTR1 存在蛋白质水平的相互作用（图 12D-E）；免疫荧光显示两者均定位于细胞质（图 12F）。综上，A2ML1 可在类器官中诱导 EMT，并与 LZTR1 在细胞质中相互作用。
图 13：A2ML1 通过下调 LZTR1 激活 KRAS/MAPK 通路促进 EMT
作者通过 RT-qPCR 和 western blotting 证实，A2ML1 敲低可上调 LZTR1 表达并抑制 MAPK 通路活性，过表达则下调 LZTR1 并激活 MAPK 通路（图 13A-B）；泛素化实验显示，A2ML1 敲低增强 KRAS 泛素化，过表达则抑制（图 13C）；Ras 激活实验表明，A2ML1 对 Ras 活性的调控可被 LZTR1 逆转（图 13D）；在 KRAS 野生型（WT）细胞中，A2ML1 敲低显著抑制 EMT 和 MAPK 信号，但在 KRAS-K117R 突变细胞中无显著变化（图 13E-G）。综上，A2ML1 通过下调 LZTR1，影响 KRAS 泛素化和激活，进而激活 KRAS/MAPK 通路以促进 EMT。
图 14：A2ML1 调控 KRAS/MAPK 信号通路的机制示意图
该图展示了 A2ML1 的调控机制：在正常胰腺中，LZTR1 表达较高，可抑制 Raf/MEK/ERK（MAPK）通路，进而抑制 EMT；在胰腺癌中，A2ML1 高表达并与 LZTR1 相互作用，下调 LZTR1 表达，解除对 MAPK 通路的抑制，激活下游转录，最终促进 EMT（图 14）。综上，该图清晰示意了 A2ML1 通过 LZTR1 调控 KRAS/MAPK 通路及 EMT 的分子机制。
图 15：研究整体流程图
该图展示了研究的三个主要步骤：第一步，整合多组学数据，通过 10 种聚类方法识别胰腺癌的两个分子亚型，并在 12 个外部队列中验证；第二步，基于 10 种机器学习方法，以 E-MTAB-6134 为训练集建立并验证预后 signature，分析其与通路、药物敏感性等的关联；第三步，验证 A2ML1 在胰腺癌中的高表达，通过功能实验证实其通过下调 LZTR1 激活 KRAS/MAPK 通路促进 EMT（图 15）。综上，该图系统概括了本研究的整体设计和 workflow。
本研究通过整合 168 个胰腺癌样本的多组学数据（转录组、甲基化、突变），利用 10 种分类方法在 13 个独立队列中识别并验证了两个预后不同的分子亚型（CS1 和 CS2），其中 CS1 为基底样亚型，预后较差且与免疫浸润、EMT 相关通路富集相关；基于 23 个预后基因，通过 101 种机器学习算法组合构建了以岭回归为最优的预后模型，其预测性能优于既往模型，风险评分与药物敏感性、临床特征显著相关；进一步发现 A2ML1 在胰腺癌组织中高表达，通过与 LZTR1 相互作用下调其表达，激活 KRAS/MAPK 通路，最终促进 EMT 以推动肿瘤进展。该研究为胰腺癌的分子分型、预后评估及精准治疗提供了新的见解和依据。
