大家好，我是小燕同学，今天为大家介绍7种常用中药靶点鉴定方法，主要包括标记类分子靶点“钓钩”策略、SILAC标记识别、点击化学和非标记类DARTS、SPROX、CESTA、TPP。
▲标记类
1. 分子靶点“钓钩”策略
i.工作原理：首先将药物分子通过化学手段进行修饰, 链接一个标签分子(如生物素), 进而利用标签分子与固相载体微球表面的活性反应基团相互作用, 将该药物分子连接到微球表面,得到药物分子修饰的固相微球，继而将微球与细胞裂解液混合, 使微球表面的药物分子捕捉靶点蛋白, 并富集到微球表面, 最后经凝胶电泳分离纯化, 高分辨质谱分析, 以及数据库序列比对, 确定该靶点蛋白的名称及属性。
ii. 适用与缺陷：①预先标记、结构修饰小分子，适用于中药单体；②需要区分真正的高亲和力靶标蛋白质与低亲和力但丰度高的蛋白质；洗脱过程依赖经验，洗涤条件过强会大大减少鉴定到的靶点数，而洗脱条件过弱则会出现假阳性结果，同时琼脂糖珠上的非特异性吸附也会造成假阳性结果；由于生物素相对分子质量较大，会在一定程度上影响化合物的脂溶性使其不易进入细胞，受空间位阻较大影响化合物与靶标蛋白的结合。
2.基于SILAC标记识别技术
i.工作原理：通过使用天然同位素(轻标)和稳定同位素(重标)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中的相应氨基酸, 使稳定同位素标记的氨基酸掺入到细胞新合成的蛋白质中, 替代原有氨基酸, 再通过高分辨质谱对稳定同位素标记的蛋白质进行精确定量。
ii.技术应用（药物靶点鉴定）：将重标同位素标记的细胞裂解液用于靶点捕获, 而轻标同位素标记的细胞裂解液作为空白对照, 然后使用定量蛋白质组学技术检测两组细胞裂解液中捕获的不同种类蛋白量的差异, 进而寻找含量差异较大的蛋白作为潜在的药物靶点进行后续研究。
iii.适用特点：适用于细胞内的低丰度蛋白特别是痕量蛋白的识别与鉴定；适用于中药单体。
3. 基于“点击化学”的靶点鉴定
i.工作原理：尽可能小的改变化合物生物活性的前提下，通过引入光交联集团、炔基或叠氮构建活性分子探针，在细胞内利用点击化学反应将药物分子与靶点蛋白直接“固定”在一起（分子探针与细胞孵育）, 再通过裂解细胞和富集靶点等操作纯化药物靶点, 最后经高分辨质谱进行靶点蛋白鉴定。
ii.特点及适用：PAL技术既帮助标记细胞或者细胞裂解液中低丰度或者与探针亲和力较弱的靶蛋白，也可标记膜上受体等通常不易鉴定的蛋白；适用于中药单体（如青蒿素、姜黄素、黄芩苷）。若与蛋白质组学芯片联用，可应用于中药复方等复杂体系靶点鉴定。
▲非标记类
4. DARTS（药物亲和反应靶标稳定性分析）
i.工作原理：利用药物结合时靶标蛋白对蛋白酶降解的敏感性降低这一特性，不需要对药物结构进行修饰且不依赖药物的活性，依赖于药物分子和其蛋白质靶点之间的亲和性，因此能够精确地找到药物的直接结合靶点。
ii.大致流程：细胞裂解、蛋白定量、加入小分子药物与裂解液共同孵育、链霉蛋白酶水解，最后采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、Western blot。
iii.适用与缺陷：适用于中药单体，但DARTS 技术受限于质谱检测灵敏度，对于许多低丰度的靶标蛋白来说不易将目标蛋白可视化，此外进化选择上有些蛋白很难被蛋白酶消化。
5. SPROX（氧化速率蛋白稳定性分析）
i.工作原理：基于蛋白质和蛋白质配体的热力学稳定性，即在化学变性剂（如盐酸胍或尿素）浓度增加的情况下利用过氧化氢氧化蛋白质中的甲硫氨酸（氧化产物为甲硫氨酸亚砜或甲硫氨酸砜），用电喷雾或基质辅助激光解吸/电离质谱法测定特定氧化时间下甲硫氨酸的氧化程度与变性剂浓度的函数，未氧化产物、氧化产物变性剂关系曲线的交点为迁移中点，由于蛋白质和其配体结合后蛋白稳定性提高，与对照组相比，在相同浓度的氧化产物下需要更多的变性剂，从而导致迁移中点右移。SPROX 优点在于不需要纯化蛋白，且可以与串联质谱标签TMT、SILAC相结合，通过标记蛋白质氨基来确定肽的相对含量。
ii. 适用与缺陷：只能检测含有甲硫氨酸的蛋白质与小分子的结合，此外并不是所有的甲氨酸残基都表现出不同的氧化速率，因此不能完全确证蛋白质和配体相互作用。
6. CESTA（蛋白质热稳定性分析）
i.工作原理：基于配体诱导的靶标蛋白热稳定性改变原理开发出 CETSA 技术，随着温度的升高，蛋白热稳定性降低，而小分子和靶标蛋白结合后会改变靶标蛋白的热稳定性。
ii.大致流程：将多个等量的细胞裂解液或者组织匀浆液或活细胞与小分子孵育，设置空白对照组和药物处理组，然后加热至不同温度进行热变性；冷却后，将样品离心，从沉淀蛋白中分离可溶性组分；通过Western blotting 法对可溶性部分中的目标蛋白进行定量，或基于质谱方法根据其熔解曲线分析可溶性蛋白的热稳定性，从而确证小分子与靶标蛋白的结合。
iii.缺陷：①较大的蛋白质包括蛋白质复合物更可能产生较弱或没有配体诱导反应，在这方面的局限性仍需充分证实；②加热会影响细胞膜的通透性，可以通过减少加热时间、选择合适的加热方式、增加对照实验来解决；③小分子的孵育时间会影响小分子识别靶标蛋白，如果此化合物参与快速响应信号通路，可能会影响靶标蛋白翻译后的状态，进而影响抗体对靶标蛋白的检测，可以使用基于质谱方法来检测靶标蛋白；④检测需要的药物浓度较高，在发现新靶点的过程中明显通量不足，常被用作靶点的验证。
7. TPP（热蛋白组分析）--多技术联用
i.简介：将 CETSA 技术和多重定量质谱相结合，可以监测药物作用过程中整个蛋白组蛋白质热稳定性的变化，增加了在靶点和脱靶识别以及生物识别上的应用，实现对靶标蛋白的高通量检测，适用于体外、原位和体内检测。
ii.大致流程：将细胞或裂解液在有无化合物条件下处理，然后将样本平均分成 10 份，在 10 个温度下分别加热，用 PBS 溶液提取可溶部分，再用胰蛋白酶处理样本并用 TMT10 进行标记，最后混合所有样本进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，得到的报告离子强度用于拟合曲线并计算每个蛋白质的特定熔解温度（Tm），从而找到稳定性差异蛋白。
