shRNA稳定敲降（Knock Down，KD）细胞系构建终极完全指南

shRNA稳定敲降（Knock Down，KD）细胞系构建终极完全指南

本节概览

一、RNA干扰与shRNA的作用机制
二、pLKO.1 载体概述与核心元件
三、pLKO 系列衍生载体与选择策略
四、shRNA 靶序列设计
五、寡核苷酸退火与克隆构建
六、阳性克隆筛选与验证
七、慢病毒包装与滴度测定
八、靶细胞感染与稳定筛选
九、敲降效率验证与时间节点
十、关键实验要点与常见问题

引言

在前几期中，我们分别探讨了 CRISPR/Cas9 基因敲除、荧光报告基因敲入、PiggyBac 转座子稳定过表达，以及 RNAi 敲降实验的对照设置方案。对于基因功能丧失研究，除了基因组水平的永久性敲除和诱导型敲降外，基于 shRNA 的组成型稳定敲降（Knock Down，KD）仍然是应用最广泛、操作最便捷的策略之一。其核心优势在于：只需一次慢病毒感染和一轮嘌呤霉素筛选，即可获得持续抑制靶基因表达的稳定细胞系，无需额外的诱导剂或时间窗口控制。

慢病毒载体因其整合稳定、宿主范围广、感染效率高的特点，已成为 shRNA 递送的主流工具。在众多慢病毒 shRNA 载体中，由 RNAi 联盟开发的 pLKO.1 及其衍生系列是最经典、最广泛应用的系统。本文将在系统介绍 shRNA 作用机制的基础上，以 pLKO.1 为核心，梳理从 shRNA 设计、克隆构建、慢病毒包装到感染筛选和效率验证的全流程。
（若使用转座子PB系统进行敲降也可参考本教程，只需更改最后病毒递送方式为转座子、转座酶双质粒转染递送即可）
以下构建流程内容主要参考Addgene: Protocol - pLKO.1 – TRC Cloning Vector：https://www.addgene.org/protocols/plko/

一、RNA干扰与shRNA的作用机制

1.1 RNA干扰概述

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种由双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）引发的、具有序列特异性的转录后基因沉默机制。这一过程在进化上高度保守，广泛存在于真核生物中，最初被认为是生物体抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。其基本原理是：与靶基因mRNA序列互补的双链RNA导入细胞后，能够特异性识别并降解该mRNA，从而阻断相应基因的表达。

RNAi发现于20世纪90年代，自问世以来迅速成为研究基因功能的重要工具。目前常用的RNAi效应分子包括小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）、短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）和microRNA（miRNA）等。其中，shRNA因其可通过质粒或病毒载体实现稳定、长期的基因沉默，在功能基因组学、基因治疗和药物靶点筛选等领域得到了广泛应用。

1.2 shRNA的细胞内加工与作用机制

shRNA是一种设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子。其典型结构包括两个短的反向重复序列（形成茎部）和中间一个茎环序列（形成环部），整体呈发夹状。shRNA的表达通常由RNA聚合酶III启动子（如人源或鼠源的U6和H1启动子）驱动，在细胞核内完成转录。

shRNA进入细胞后，通过劫持细胞内源的miRNA加工机器来完成成熟和功能化。其作用路径可分为以下四个关键步骤：
《Short hairpin RNA-mediated gene silencing》

第一步：转录与出核

shRNA编码序列在RNA聚合酶III启动子的驱动下转录产生初级shRNA转录本。该转录本随后被转运出细胞核，进入细胞质。

第二步：Dicer酶切

在细胞质中，shRNA被一种称为Dicer的RNase III家族核酸内切酶识别并结合。Dicer将shRNA的发夹结构切除环部，产生成熟的siRNA双链（约19–22 nt）。人源Dicer通常与TRBP（TAR RNA binding protein）等辅助蛋白协同作用，以确保底物的有效加工。

第三步：RISC复合物组装

Dicer切割产生的siRNA双链随后与RNA诱导的沉默复合物（RNA-Induced Silencing Complex, RISC） 结合。RISC的核心组分包括Argonaute 2（Ago2）蛋白。在RISC中，siRNA双链被解旋，其中一条链（“过客链”，passenger strand）被降解，另一条链（引导链，guide strand）则保留在RISC中，成为指导基因沉默的序列模板。

第四步：靶mRNA识别与降解

装载了引导链的RISC复合物通过引导链与靶mRNA之间的碱基互补配对，特异性识别并结合靶mRNA。当引导链与靶mRNA完全互补时，RISC中的Ago2蛋白会切割靶mRNA，导致其被细胞核酸外切酶进一步降解，从而阻断该基因的翻译。若引导链与靶mRNA之间仅存在部分互补，RISC则主要通过翻译抑制和脱腺苷酸化等途径介导基因沉默，但这一通路主要用于miRNA的调控，shRNA的设计通常追求完全互补以触发mRNA切割。

1.3 shRNA相较于siRNA的优势

与化学合成的siRNA相比，shRNA表达载体具有以下显著优势：

• 持久性：shRNA可通过质粒或病毒载体整合入宿主基因组，实现长期、稳定的基因沉默，可持续数周甚至更久；而化学合成siRNA在细胞内仅维持3–7天的瞬时效应。
• 可诱导性：通过使用四环素等诱导型启动子系统，可实现对基因沉默的时间特异性调控，满足必需基因或剂量依赖性研究的需要。
• 便于筛选：载体通常携带抗生素抗性基因或荧光标记，便于阳性细胞的筛选和富集。
• 适用性广：慢病毒等病毒载体可高效感染多种难以转染的细胞类型，如原代细胞、悬浮细胞和终末分化细胞。

正是基于上述机制和优势，pLKO系列载体得以通过表达shRNA来实现对目标基因的特异性敲降，为基因功能研究提供了强有力的工具。

二、pLKO.1 载体概述与核心元件

pLKO.1 是 RNAi 联盟（TRC）用于构建 shRNA 表达文库的慢病毒骨架载体。该载体为复制缺陷型，既可通过直接转染引入细胞，也可包装为慢病毒颗粒感染靶细胞。载体携带嘌呤霉素抗性基因，便于稳定整合细胞的筛选。

pLKO.1-TRC 克隆载体含有一个酶切填充片段，位于 AgeI 和 EcoRI 酶切位点之间。通过双酶切释放填充片段后，可将退火形成的 shRNA 双链寡核苷酸克隆入该区域。shRNA 的转录由人 U6 启动子驱动，该 Pol III 型启动子具有精确的起始和终止特性，非常适合小 RNA 的转录。

pLKO.1 关键元件一览

shRNA 转录产物结构

shRNA 由 U6 启动子转录后，其初级转录本结构为：

5′-Sense strand (21 bp) — CTCGAG loop — Antisense strand (21 bp) — TTTTTT-3′

其中 Sense strand 与靶 mRNA 互补（21 bp），loop 为 CTCGAG（XhoI 识别位点，可用于后续限制性酶切鉴定，此外也常用9bp loop：TTCAAGAGA），Antisense strand 为 Sense strand 的反向互补序列，3′ 末端的 TTTTTT 为 Pol III 转录终止信号。

三、pLKO 系列衍生载体与选择策略

所有 pLKO 系列载体的核心克隆构建方法完全一致——包括寡核苷酸设计、退火、AgeI/EcoRI 酶切连接、转化筛选等步骤，均沿用 pLKO.1 的标准流程。各衍生版本的区别仅在于调控方式（组成型 vs 诱导型）或筛选标记（药筛 vs 荧光）。以下是四种常用载体的比较：

选择建议：

• 对于绝大多数组成型稳定敲降实验，pLKO.1-puro 是经典首选。
• 若发现特定 shRNA 敲降效率不理想，可尝试换用 TRC2-pLKO-puro（WPRE 元件提升表达量），无需额外修改实验流程。
• Tet-pLKO-puro 需在培养基中添加 Doxycycline（1 μg/mL）诱导 shRNA 表达，适用于必需基因或需要时间窗口控制的实验。
• pLKO.3G 筛选时不使用嘌呤霉素，而是通过流式细胞术或荧光显微镜挑取 GFP 阳性细胞，适合需要荧光追踪的实验设计。

提示：EZ-Tet-pLKO-puro (Tet-pLKO-puro的改进型)诱导型系统的详细操作流程和对照设置方案，将作为本系列的下一个独立篇章进行介绍。

四、shRNA 靶序列设计

选择合适的靶序列是敲降实验成功的关键步骤。推荐使用成熟的 siRNA 设计工具（如 Whitehead 研究所的 siRNA Selection Program、Broad Institute GPP Portal 或 Sigma MISSION® shRNA 平台）进行辅助设计。

设计原则

• 从起始密码子 ATG 下游 25 bp 开始，寻找符合 AA(N19) 模式的 21 bp 序列；若无理想序列，可搜索 NAR(N17)YNN 模式（N=任意碱基，R=A/G，Y=C/U）
• GC 含量控制在 36%–52% 之间
• 有义链 3′ 端（第 15–19 位）应至少含有一个 A 或 T，以降低末端热力学稳定性，有利于引导链进入 RISC
• 避免靶向内含子，确保靶序列位于成熟 mRNA 的编码区或 3′ UTR
• 避免连续 4 个及以上相同核苷酸，尤其是 polyT 序列（polyT 为 RNA 聚合酶 III 的转录终止信号，会导致 shRNA 转录提前终止）
• 通过 NCBI BLAST 进行全转录组比对，确保与非靶基因之间至少存在 3 个碱基错配，降低脱靶效应
• 建议为每个基因至少设计 2–3 条独立 shRNA：不同序列若产生一致的敲降表型，可有力地排除脱靶效应

shRNA设计示例

以下以Broad Institute GPP Portal 网站进行人的P53 基因的shRNA实验设计为例：
https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/gene/search

1. 输入要进行敲降的基因官方名 TP53进行search（注意一定要是NCBI上的官方名，例如我们P53基因官方名实际为TP53）

   
   

2.确认基因名无误，点击show all ...进行展示

3. 选择Adjusted Score得分高的2-3条shRNA，请注意，这里1.2与3.4实际是同一条序列不同载体，不要选重复了

   
   

寡核苷酸合成

将选定的 21 bp 靶序列按以下格式合成寡核苷酸。两端序列为克隆所需，不可更改：

正向寡核苷酸（5′→3′）：

CCGG—(21 bp Sense)—CTCGAG—(21 bp Antisense)—TTTTTG

反向寡核苷酸（5′→3′）：

AATTCAAAAA—(21 bp Sense)—CTCGAG—(21 bp Antisense)

示例（靶序列为 AATGCCTACGTTAAGCTATAC）：

• 正向：CCGGAATGCCTACGTTAAGCTATACCTCGAGGTATAGCTTAACGTAGGCATTTTTTG
• 反向：AATTCAAAAAAATGCCTACGTTAAGCTATACCTCGAGGTATAGCTTAACGTAGGCATT

设计逻辑简要说明：正向链 5′ 端 CCGG 为 AgeI 粘性末端，3′ 端 TTTTTG 为终止信号及悬垂碱基；反向链 5′ 端 AATTCAAAAA 包含 EcoRI 粘性末端和终止信号的互补序列。退火后形成两端分别与 AgeI 和 EcoRI 酶切末端互补的粘性末端，可直接连入线性化载体。

五、寡核苷酸退火与克隆构建

1. 寡核苷酸退火

将合成的正向和反向寡核苷酸冻干粉用 ddH₂O 分别溶解至 20 μM。（也可以参考之前基因敲除系列文章中10ul退火体系）

退火体系（50 μL）：

退火程序：95°C 加热 4 分钟 → 70°C 10 分钟，随后在数小时内缓慢冷却至室温。可将 PCR 管置于 95°C 水浴中自然降温完成，或使用 PCR 仪执行梯度降温程序。缓慢冷却对有效退火至关重要——快速冷却会导致单链自身折叠形成二级结构，显著降低有效双链的比例。

2. 载体双酶切（去除填充片段）

pLKO.1 载体需经 AgeI 和 EcoRI 双酶切以去除 填充片段。

50 μL 体系

37°C 孵育 2 小时。酶切产物经纯化试剂盒纯化，以 30 μL ddH₂O 洗脱。

将双酶切产物进行 0.8% 琼脂糖凝胶电泳。切下大片段约 7 kb 条带，使用凝胶回收试剂盒纯化线性化载体，测定浓度备用。

关键提示：观察 DNA 条带时使用长波 UV 光，短波 UV 会诱导 DNA 损伤，降低连接效率和克隆成功率。

3. 连接与转化

连接反应（20 μL 体系）：（可改为10ul）

16°C 孵育 4–20 小时或4度过夜。

转化：

取 2 μL 连接产物转化 25 μL 化学感受态细胞，涂布于含 100 μg/mL 氨苄青霉素（或羧苄青霉素）的 LB 平板，37°C 倒置培养过夜。

重要提示：慢病毒载体含有 LTR 重复序列，在大肠杆菌中易发生同源重组导致质粒缺失或重排。强烈建议使用重组缺陷型菌株（如 Stbl3 或 NEB Stable 感受态细胞）进行转化，以维持载体完整性并提高质粒产量。DH5α 等常规克隆菌株在培养 pLKO 系列载体时可能出现重排产物。

六、阳性克隆筛选与验证

1. 菌落挑选

从平板上挑取 多个单克隆，分别接种于 5 mL 含氨苄青霉素（100 μg/mL）的 LB 液体培养基中，37°C 摇菌。

2. 限制性酶切鉴定（可省略，直接摇菌送测）

使用 EcoRI 和 NcoI 进行双酶切鉴定：

37°C 孵育 1–2 小时，1% 琼脂糖凝胶电泳检测。阳性克隆应可见约 2 kb 和 5 kb 两条特征条带（条带位置因插入序列微小差异可能略有偏移）。

3. Sanger 测序验证

将酶切鉴定阳性（可省略鉴定直接送测）的克隆送测序，使用 pLKO.1 测序引物：

引物序列：(5’ CAA GGC TGT TAG AGA GAT AAT TGG A 3’) 可需要根据自己载体设计

测序时应完整读取插入区域，确认 21 bp Sense、CTCGAG loop、21 bp Antisense 及 TTTTTT 终止信号的序列完全正确。若测序时 DNA 聚合酶难以通过 shRNA 发夹二级结构区域导致信号衰减，可尝试调整测序条件（如添加 DMSO 或使用专门针对发夹结构的测序试剂）。

七、慢病毒包装与滴度测定

生物安全提醒：慢病毒生产涉及 HIV 衍生载体，操作前必须获得所在机构生物安全办公室的批准，并在 BL2 或更高级别实验室中进行。请严格遵守所在机构及 CDC/NIH 的相关安全指南。

1. 包装系统

采用第二代慢病毒包装系统，需要三种质粒：

• 转移质粒：pLKO.1-shRNA（含目的 shRNA）
• 包装质粒：psPAX2（Addgene #12260，表达 Gag-Pol）
• 包膜质粒：pMD2.G（Addgene #12259，表达 VSV-G）

2. 包装流程（以 6 cm 培养皿为例）

第 1 天（铺板）：将 7×10⁵ 个 HEK-293T 细胞铺于 6 cm 培养皿（含 5 mL DMEM + 10% FBS，不加抗生素），过夜培养。

第 2 天（转染，下午进行）：

• 配制 DNA 混合物（每皿一份）：pLKO.1-shRNA 1 μg + psPAX2 750 ng + pMD2.G 250 ng，用 OPTI-MEM 补至 20 μL。
• 配制转染试剂预混液（以 FuGENE® 6 为例，每皿一份）：6 μL FuGENE + 74 μL OPTI-MEM。操作要点：先将 OPTI-MEM 加入管中，再将 FuGENE 直接加入液体中，勿接触管壁。轻轻混匀后，室温孵育 5 分钟。
• 将 80 μL 转染试剂预混液加入 20 μL DNA 混合物中（总体积 100 μL），轻轻混匀，室温孵育 20–30 分钟。
• 将混合物逐滴加入 293T 细胞培养液中（细胞汇合度应在 50%–80%），轻晃培养皿混匀，切勿剧烈晃动。
• 37°C 培养 12–15 小时。

第 3 天（换液）：转染后次日（上午），吸去含转染试剂的培养基，沿培养皿侧壁缓缓加入 5 mL 新鲜 DMEM + 10% FBS + 青/链霉素，继续培养 24 小时。

第 4 天（首次收集）：收集含病毒颗粒的培养上清，4°C 暂存。向细胞中补加 5 mL 新鲜培养基，继续培养。

第 5 天（二次收集）：再次收集培养上清，与第 4 天的病毒液合并。1,250 rpm 离心 5 分钟沉淀细胞碎片，或用 0.45 μm PES 滤器过滤。切勿使用 0.2 μm 滤器——VSV-G 包膜蛋白为大型糖蛋白，0.2 μm 孔径可剪切包膜结构，大幅降低病毒感染活性。病毒液可分装后冻存于 -80°C。注意：反复冻融会显著降低病毒滴度，建议分装为单次使用量。

3. 滴度测定

将靶细胞铺于 96 孔板，密度约 30%–40%。次日加入梯度稀释的病毒上清（如 1:10、1:100、1:1000、1:10000），同时加入 polybrene（终浓度 8 μg/mL）以提高感染效率。感染 48 小时后，加入嘌呤霉素开始筛选。继续培养 3–4 天，计数各稀释度下的存活细胞克隆数。

滴度计算公式：TU/mL = 克隆数 × 稀释倍数 / 加入病毒体积（mL）

典型滴度应达到 10⁶–10⁷ TU/mL。若滴度偏低，可从 293T 细胞状态（低代次、高活力）、质粒 DNA 纯度（A260/A280>1.8）和转染效率（可通过荧光对照质粒监测）三个方面排查。

八、靶细胞感染与稳定筛选

1. 嘌呤霉素工作浓度测定（必做步骤）

不同细胞系对嘌呤霉素的敏感性差异显著，正式实验前必须进行致死曲线测定：
（常用浓度为1μg/mL）

• 将靶细胞铺于多个培养皿，过夜培养
• 次日加入含不同浓度嘌呤霉素的完全培养基，建议设置 0.5–10 μg/mL 范围
• 每两天更换含药新鲜培养基，每天观察细胞死亡情况
• 以 3–5 天内导致完全细胞死亡的最低浓度 作为正式实验的筛选工作浓度

2. 感染与筛选流程

第 1 天：铺靶细胞，密度以感染时达到约 70% 汇合度为宜，过夜培养。

第 2 天（感染）：

• 更换为含 8 μg/mL polybrene 的新鲜培养基（若靶细胞对 polybrene 敏感，可换用鱼精蛋白硫酸盐替代）
• 加入慢病毒液（6 cm 皿推荐加 0.5–1 mL 为高 MOI 条件，0.1 mL 为低 MOI 条件，可根据预实验调整）
• 37°C 过夜感染

第 3 天（换液）：

• 感染 24 小时后更换新鲜培养基（若观察到明显病毒毒性，可缩短感染时间至 4–20 小时）
• 注意：至少等待感染 24 小时后再加入嘌呤霉素筛选，确保抗性基因已充分表达
• 加入步骤 8.1 确定的嘌呤霉素工作浓度开始筛选
• 务必保留一皿未感染细胞作为平行对照，同步加入嘌呤霉素，以验证药物杀伤效果

第 4 天及之后：每 2–3 天更换含嘌呤霉素的新鲜培养基，持续筛选直至未感染对照组细胞全部死亡（通常 5–7 天）。存活细胞即为稳定整合的混合细胞池，可用于后续敲降效率鉴定和表型实验。

3. 混合细胞池与单克隆的选择

药物筛选后获得的混合细胞池已可直接用于大多数敲降效率验证和初步表型实验。若后续实验对表达均一性有较高要求，可通过有限稀释法挑取单克隆并鉴定。但需注意，与基因敲除不同，shRNA 敲降实验通常使用混合群体即可满足需求，且避免了单克隆异质性带来的选择偏差。

九、敲降效率验证与时间节点

检测时间指南（可根据细胞系进行优化）

效率评估方法

qPCR 检测 mRNA 水平：以未感染细胞或空载体感染细胞为对照，使用 ΔΔCt 法计算靶基因的相对表达量。有效 shRNA 应使 mRNA 降至对照的 30% 以下（即敲降效率 ≥70%）。

Western blot 检测蛋白水平：灰度分析定量，有效 shRNA 应使蛋白降至对照的 50% 以下。长半衰期蛋白需要更长的检测等待时间。

多序列验证

每个基因至少使用 2–3 条独立 shRNA 重复实验。若多条序列产生一致的敲降表型，脱靶效应的可能性大幅降低。这是 RNAi 实验中最基本也最重要的验证环节。

十、关键实验要点与常见问题

1. 菌株选择不当导致质粒重排

慢病毒载体含有 LTR 重复序列，在 DH5α 等常规克隆菌株中易发生同源重组，导致质粒缺失或大小异常。必须使用 Stbl3 或 NEB Stable 等重组缺陷型菌株进行转化和扩增，这是 pLKO 系列载体操作中最容易被忽视也最关键的技术细节。

2. 寡核苷酸退火不充分

退火的目的是形成具有正确粘性末端的双链 DNA。快速冷却会导致单链分子内折叠形成二级结构，显著降低有效双链比例，导致连接效率极低或克隆失败。必须确保缓慢降温（数小时自然冷却至室温），不可用冰上骤冷替代。

3. 酶切不完全产生高背景

填充片段若未被完全切除，残留的环状质粒在转化后会产生大量空载体背景菌落。凝胶回收时必须确认两条带清晰分离，且仅回收 7 kb 骨架条带。观察凝胶时使用长波 UV，避免短波 UV 对 DNA 的损伤。

4. 慢病毒包装效率与滴度

293T 细胞状态是决定病毒滴度的首要因素——应使用低代次、形态均一的 293T 细胞。质粒 DNA 需用去内毒素试剂盒提取。若滴度低于 10⁶ TU/mL，建议从这三个方面逐一排查。病毒上清过滤必须使用 0.45 μm 滤器而非 0.2 μm 滤器。

5. 嘌呤霉素筛选浓度不可直接套用

不同细胞系对嘌呤霉素的敏感性差异可达数倍。直接引用文献中的浓度而不进行本实验室的致死曲线测定，可能导致筛选不彻底（浓度过低，假阳性存活）或细胞全部死亡（浓度过高）。致死曲线测定是筛选前的必做步骤。

6. 脱靶效应的排除

单条 shRNA 的表型不能直接归因于靶基因的沉默。必须使用至少 2 条靶向同一基因不同位点的独立 shRNA，若获得一致表型方可建立因果关系。此外，通过回补实验（表达 shRNA 靶向区域之外的沉默抗性 cDNA）可提供更高层面的证据支持。

结语

从shRNA在细胞内经历Dicer加工、RISC装载到靶mRNA切割的精密分子机制，到pLKO.1载体上U6启动子驱动的shRNA转录单元设计，再到从寡核苷酸退火、克隆构建、慢病毒包装到感染筛选的完整实验链条——本文系统呈现了基于pLKO.1的组成型shRNA稳定敲降技术体系。

在这套体系中，shRNA靶序列的理性选择（多序列并行设计、脱靶评估）、克隆过程中对技术细节的把控（退火缓慢降温、使用Stbl3菌株、测序验证全序列）以及感染筛选的标准化（致死曲线测定、polybrene辅助感染、合理设置感染后等待时间），共同决定了最终敲降效率的高低和实验结论的可靠性。

从基因敲除到敲入，从过表达到组成型敲降，本系列已逐步构建起一套基因功能研究的核心技术工具箱。如果您需要在时间维度上精确控制基因沉默的开启——例如研究必需基因的功能或进行剂量-效应分析——诱导型敲降系统将是更适宜的选择。

敬请关注下期：EZ-Tet-pLKO-Puro 诱导型shRNA敲降细胞系构建全解析。