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2025年，英国牛津大学Dimitrios V. Vavoulis和Anna Schuh研究团队在《Nature Communications》期刊发表了题为“Multimodal cell-free DNA whole-genome TAPS is sensitive and reveals specific cancer signals”的科研成果，研究开发并验证了一种基于TET辅助吡啶硼烷测序（TET-Assisted Pyridine Borane Sequencing,TAPS）的深度全基因组测序技术，用于游离循环肿瘤DNA（ctDNA）的拷贝数变异、体细胞突变和DNA甲基化信号多模态检测。
研究采用诊断准确性病例对照设计，纳入61例经确诊的癌症患者（涵盖结直肠癌、食管癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌和乳腺癌）及30例非癌症对照，通过深度全基因组TAPS测序（≥80x），同步分析基因组拷贝数变异（CNA）、体细胞点突变/插入缺失（SNV/INDEL）、以及DNA甲基化修饰三种数据模态，实现血浆游离ctDNA的高灵敏度检测。结果显示TAPS+在早期癌症检测中灵敏度达94.9%，特异性88.8%，并在ctDNA分数低至0.7%时仍保持良好的AUC区分能力。此外，研究还展示了该技术在无匹配肿瘤活检条件下，对结直肠癌术后微小残留病灶（MRD）及辅助治疗反应的监测能力。
英文标题：Multimodal cell-free DNA whole-genome TAPS is sensitive and reveals specific cancer signals
译文标题：多模态游离DNA全基因组TAPS技术高灵敏度揭示特异性癌症信号
发表期刊：Nature Communications
影响因子：IF15.7/Q1
技术平台：TAPS
作者单位：牛津大学、武汉大学
研究方法
（1）研究设计与队列：
病例组(GEL)：61名经确诊的有症状癌症患者，包括结直肠癌、食管癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌和乳腺癌。
对照组1 (SCAN)：21名有非特异性症状但两年内未确诊癌症的患者，用于背景信号去噪。
对照组2 (CBS)：9名无症状、年龄和性别匹配的健康人，作为阴性对照。
（2）样本处理与测序：
血浆cfDNA提取：从患者血液中提取游离DNA（cfDNA）。
建库测序：TET辅助吡啶硼烷测序（TAPS）处理，TAPS特异性地将甲基化胞嘧啶（5mC）和羟甲基胞嘧啶（5hmC）转化为胸腺嘧啶（T），而非甲基化胞嘧啶保持不变，从而保留基因组序列的完整性。对血浆cfDNA进行≥80x深度的全基因组双端测序。同时对匹配的gDNA进行30x测序，用于过滤胚系突变。
（3）数据分析
比对：将测序读段（FASTQ）比对至人类参考基因组GRCh38。
拷贝数变异（CNA）分析：样本特异性CNA评分。
体细胞突变（SNV/INDEL）分析：去除gDNA种系变异、去除TAPS诱导的甲基化伪变异、质量过滤，利用SCAN样本合并VCF去除共有变异。
甲基化分析：识别TAPS特异性mC→T（正链）和G→A（反链）转换，区分真实甲基化与C→T变异。碱基质量≥30，要求链特异性支持。
（4）多模态整合
主要方法(Stouffer法)：将CNA、SNV/INDEL和甲基化三种模态的p值通过Stouffer方法整合，得到一个多模态ctDNA评分。
辅助方法：Fisher法、逻辑回归、随机森林和支持向量机等机器学习方法。
肿瘤分数推断：对存在CNA的样本，基于覆盖度数据推断ctDNA分数。
（5）性能验证：
体外模拟：通过模拟不同ctDNA分数（0.1%-2%）的病例和对照数据，评估ROC曲线下面积（AUC）。
留一法交叉验证(LOO-CV)：逐个移除样本，用剩余样本训练模型并对移除样本预测，评估模型泛化能力。
结果图形
（1）病例-对照设计
研究纳入61名癌症患者（病例组，GEL）和30名非癌症个体（对照组，包括21名SCAN和9名CBS）。在癌症患者中，71%年龄在60岁及以上，中位年龄为67.5岁。结直肠癌是最常见的癌种（占近三分之二），其次是食管癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌和乳腺癌。研究覆盖了从I期到IV期的各个阶段，其中大多数患者处于II期（32.8%）和III期（57.4%）。该设计旨在模拟真实的早期癌症检测场景，其中未使用匹配的肿瘤活检来指导ctDNA分析，而是将其仅用于验证。
图1：研究概述
（2）ctDNA染色体变异分析
拷贝数变异（CNA）是癌症的早期标志，表现为染色体片段的获得或丢失。研究对每个cfDNA样本进行1 kb窗口覆盖率分析，经GC含量、mappability校正和基于SCAN对照的主成分去噪后，计算每个染色体片段的聚合覆盖率z-score（图2A）。以9例CBS对照为基准，检测到显著的染色体片段获得或丢失。在61例癌症样本中，29例检测到CNA信号，总体灵敏度47.5%，特异性100%（CBS对照均为零）。各癌症类型的CNA检出情况为：结直肠癌15/36、食管癌3/8、胰腺癌5/6、肾癌3/5、卵巢癌2/4、乳腺癌1/2（图2B）。其中中位整合CNA评分随癌症分期增加而单调递增，表明该信号与疾病进展相关（图2C）。进一步通过体外模拟显示，在ctDNA分数低至0.7%时，AUC可达80%（图2D），说明CNA分析在低丰度样本中仍具潜力。
图2：拷贝数变异（CNA）分析
（3）ctDNA体细胞突变负荷分析
研究通过分析体细胞突变（SNV/INDEL）的染色体臂分布来检测ctDNA，研究团队通过配对胚系样本和SCAN对照双重去噪，保留特异性突变。癌症血浆样本的平均突变数量（平均值=425.8）远高于非癌症对照（平均值=151.1），其中胰腺癌样本的突变负荷最高（图3A）。基于染色体臂的突变密度z-score分析，检测到32例癌症样本具有显著增高的突变负荷，灵敏度52.5%，特异性100%。图3Bii展示了各癌症类型的突变检出情况。综合突变评分在异常样本中范围为2.63-23.2，CBS对照均为0（特异性100%）。评分与分期中度相关（Spearman r=50%）（图3Ci、Cii）。体外模拟实验表明，在ctDNA分数≥1%时，AUC≥74%（图3D），这与100x测序深度下最小变异等位基因频率（VAF）的理论阈值一致。
图3：体细胞单核苷酸变异（SNVs）和INDELs的负荷分析
（4）ctDNA甲基化信号分析
研究从TCGA数据库中提取五种癌症类型（结直肠、食管、肾、胰腺、卵巢）的高甲基化区域，最终筛选出377个高置信区域，每个区域至少包含3个差异甲基化CpG位点。研究人员采用片段中心分析方法，将cfDNA片段中甲基化比例＞80%定义为“肿瘤来源片段”。经SCAN对照去噪后，比较每个癌症样本与CBS对照在各区域的肿瘤片段比例。结果显示28例癌症样本检出显著增高的甲基化负荷，灵敏度45.9%，特异性100%。图4Aii展示了各癌症类型的甲基化检出情况。图4Bii同样显示了中位整合甲基化评分随癌症分期的单调递增关系（图4Bi、Bii）。体外模拟显示，在ctDNA分数为0.9%时，AUC可达到87%（图4C）。值得注意的是，TAPS技术保留了DNA完整性，使得基于片段的高甲基化分析成为可能，这是传统DNA甲基化测序难以实现的。
图4：甲基化分析概述
（5）ctDNA多组学整合分析
研究采用Stouffer法将CNA、SNV/INDEL和甲基化三种模态的特异性p值（等权重）整合为单一综合评分。结果显示，整合分析后灵敏度显著提升至85.2%（52/61例癌症正确检出），特异性仍保持100%（CBS对照评分均为零），显著高于任何单一模态模态（图5A）。此外，结果还显示阳性结果覆盖早期（I-II期）和晚期（III-IV期）病例，综合评分随分期单调递增（图5Bi、Bii）。体外模拟显示，在ctDNA分数0.7%时，AUC达86%（图5C）。留一法交叉验证进一步确认了85.2%灵敏度和88.8%特异性，AUC为83.5%。研究还比较了其他整合方法（Fisher法、逻辑回归、随机森林、支持向量机），在所有测试的整合方法中，Stouffer法和Fisher法表现最佳。TAPS技术同时保留了基因组和甲基组信息，使得三种模态的整合成为可能，而传统甲基化测序无法同时进行SNV分析。
图5：ctDNA数据多模态整合分析
（6）ctDNA多模态检测在无匹配肿瘤样本下结直肠癌术后MRD和辅助治疗反应监测中的应用
最后，研究评估了TAPS测序在术后监测中的应用。纳入10例术前ctDNA阳性的结直肠癌患者，分析术后及辅助治疗后的血浆样本，未使用匹配肿瘤组织指导分析。结果显示：5例未接受辅助治疗的患者中，3例术后ctDNA持续阳性，分别出现转移性直肠癌、低度异型增生管状腺瘤等事件；2例ctDNA清除者长期无进展生存。5例接受辅助治疗的患者中，ctDNA状态与临床结局高度一致（9/10例符合）。图6C展示了ctDNA阴性患者的事件无进展生存期显著延长（HR 8.2，；95% CI 1.3-53.1；p = 0.02）。该结果表明，TAPS测序在无匹配肿瘤组织即可同时监测基因组和表观基因组变化，从而规避了临床中组织样本获取延迟或克隆进化导致的监测失败风险。
图6：无匹配肿瘤条件下，多模态ctDNA检测用于结直肠癌术后MRD监测及辅助治疗反应追踪
结论和启示
本研究开发并验证了一种基于多模态游离DNA全基因组TAPS测序（TAPS+测序）的新型液体活检技术。该技术通过整合CNA、SNV/INDEL和甲基化三种信号，在症状性患者队列中实现了六种癌症的高灵敏度和特异性早期检测，并能有效追踪术后MRD和治疗反应。该方法为在临床实践中实施基于液体活检的多癌种早期检测提供了一条有希望的新路径。
TAPS技术的核心优势
与传统DNA甲基化测序技术相比，TAPS仅转化5%甲基化胞嘧啶而非95%非甲基化胞嘧啶，显著减少了对珍贵ctDNA样本的破坏，同时保留完整遗传信息，使得单次测序即可同步获取基因组和甲基化组信息，实现了“深度与广度”的双组学完美结合。
参考文献：
Vavoulis DV, Cutts A, Thota N, Brown J, Sugar R, Rueda A, Ardalan A, Howard K, Matos Santo F, Sannasiddappa T, Miller B, Ash S, Liu Y, Song CX, Nicholson BD, Dreau H, Tregidgo C, Schuh A. Multimodal cell-free DNA whole-genome TAPS is sensitive and reveals specific cancer signals. Nat Commun. 2025 Jan 8;16(1):430. doi: 10.1038/s41467-024-55428-y.
