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本文属于单肿瘤分型思路，类似的分型文章我们也解读过很多。

肿瘤分型文章比较重要的结论就是分型后构建的评分能够预测免疫治疗或者其他治疗的疗效。
可以用于分型的基因集很多，比如焦亡，铁死亡，自噬，铜死亡，m7G，细胞衰老等等。

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研究概述：谷氨酰胺(Gln)代谢在癌症中起重要作用。然而在肺腺癌中的作用还缺乏全面的分析。本研究基于73个Gln代谢相关基因，对513例肺腺癌(LUAD)患者的Gln代谢模式进行综合评价。以差异表达基因(DEGs)为基础，采用Cox回归和Lasso回归分析构建风险模型，使用多组数据验证该模型的预后疗效及免疫治疗性能。并利用单细胞测序分析、转录组测序和一系列体外实验来探讨EPHB2在LUAD中的作用。

研究流程图：

研究结果：

一、LUAD中谷氨酰胺代谢相关基因的遗传变异分析

1、从MSigDB和已发表数据鉴定出73个Gln代谢基因，基于单因素Cox回归分析，选择21个与生存相关的Gln代谢基因进一步分析其体细胞突变和CPS1中最高的体细胞突变率。（图2A-B）

2、此外，还对CNV的位置、扩增和缺失的频率进行分析。差异表达分析显示，肿瘤中有13个基因表达显著上调，而4个基因表达下调，相关网络显示了21个生存相关基因之间的表达相关性。（图2C-F）

二、构建不同的Gln簇

1、将513例LUAD患者分为4种Gln簇，PCA显示4个聚类之间的Gln代谢基因存在显著差异。生存分析显示，C4组患者预后得到改善，C1组患者总生存期较差。大多数谷氨酸代谢基因在C1和C2簇中显著上调，C4簇显示Gln代谢降低，且Gln代谢相关基因广泛低表达。（图3A-D）

2、大多数浸润性免疫细胞的丰度从C1簇到C4簇逐渐增加，这与Gln的代谢活性成反比。APC共刺激、HLA、T细胞共刺激和II型IFN反应显示出具有高活性抗原呈递和抗肿瘤免疫的趋势（图3E-F）

三、基于DEGs的基因簇构建

1、筛选出4个簇中的237个DEGs，进行单因素Cox回归分析，鉴定出35个与生存相关的DEGs进一步分为3个基因簇。基因簇A表现出显著的生存劣势。PCA分析显示，不同基因簇之间的维度存在明显差异。（图4A-C）

2、不同基因簇之间的DEGs存在显著差异，且大多数基因簇在基因簇A中表达上调，基因簇A也表现出较低的大多数浸润性免疫细胞和免疫功能。（图4D-F）

四、风险模型的开发和验证

1、基于最小的35个生存相关DEGs和18个生存相关代谢相关基因进行了Lasso回归分析；根据Akaike（AIC）值对18个基因进行多变量Cox回归分析，最终得到10个Gln代谢相关基因（EPHB2、CAV2、RTN2等）。（图5A-B）

2、将TCGA及GEO队列的LUAD分为低危组和高危组。低风险组中谷氨酰胺代谢相关基因含量丰富；K-M生存曲线显示低风险组患者具有显著的生存优势。ROC曲线揭示了模型在预测LUAD患者总生存率的优秀性能（图5C-F）

3、以山东医院33例LUAD患者的个体验证队列对风险模型进行验证。同样，与高危组相比，低风险组的患者显示出显著的生存优势；ROC曲线显示了风险评分在预测预后方面的表现良好。（图5G-J）

4、C4表现出明显较低的风险评分。基因簇A的患者的风险评分最高，而基因簇B的患者的风险评分最低。（图5K-L）

五、TMB及药敏分析

1、Spearman分析显示，风险评分与TMB呈显著正相关，高危组患者的TMB水平高于低危组。高TMB和低风险的患者具有显著的生存优势，低TMB组和高风险组表现出明显的生存劣势（图6A-C）。

2、与低风险评分的患者相比，高危组患者的体细胞突变频率明显更高（图6D-E）

3、84种药物在高危组中半抑制浓度值较低，低风险组的患者对18种药物敏感。（图6F）

六、谷氨酰胺代谢的分布和风险评分

1、存活组、I期、T1期和N0期患者的风险评分较低，但M期的风险评分无差异。与风险评分相似，死亡患者的Gln代谢水平更高（图7A-F）。

2、Gln代谢水平与T、N、M分期呈显著正相关，分期越高，说明Gln代谢水平越高；高危组预后的谷氨酰胺代谢相关基因显著上调；风险评分较高的患者显示谷氨酰胺代谢水平较高（图7G-L）

七、对高、低危组中TME的评价和免疫治疗疗效的预测

1、对两组细胞进行GSVA富集分析显示，低危组的胆汁酸代谢显著上调，KRAS信号通路被抑制，高危组中各种致癌通路被激活，提示可能与Gln代谢呈正相关。（图8A）

2、低风险组中，参与抗原呈递、加工和肿瘤杀伤的各种免疫细胞的存在水平较高；低风险组也表现出活跃的抗原识别、加工和呈递信号，以及抗肿瘤作用。此外，低风险组表现出较高的免疫检查点表达。风险评分也与其他致癌途径呈正相关。（图8B-D）

3、低风险评分与高免疫评分显著相关；低风险的患者表现出较高水平的T细胞功能障碍和较低水平的T细胞排斥和TIDE评分，与高危组相比，低危组的IPS也更高表明低风险评分的患者对免疫治疗更为敏感(图8E-K）

4、使用已确认的独立队列，包括ACT治疗的黑色素瘤、抗PD-1抗体等等，用于验证风险评分在预测免疫治疗预后和疗效方面的表现。（图9A-O）

5、低风险评分的患者对免疫治疗更为敏感；与高危组相比，低危组患者具有显著的生存优势，并采用ROC曲线检验其预测性能；使用基于TCGA队列的TIDE网站计算了患者对抗PD1和抗CTLA4治疗的反应；低风险组的患者被确定为免疫治疗的应答者；高危组的患者从抗PD1和抗CTLA4免疫治疗中获益的可能性较小。

八、泛癌患者风险评分的预后验证及预测生存率列线图的建立

1、对TCGA中除LUAD外的32种肿瘤的高、低风险组患者进行了生存分析发现，低危组患者有显著的生存优势(图10A-B）

2、整合风险评分、年龄和临床病理参数，开发了一个列线图来预测1、3、5年的OS率，构建的列线图在TCGA-LUAD队列中的性能与理想模型相当，列线图在预测1年、3年和5年的OS率方面总是表现较好。（图11A-E）

九、从单细胞水平上分析谷氨酰胺代谢

1、Gln代谢相关基因的表达在恶性细胞中表达上调，而在免疫细胞中其代谢表达最低。ssGSEA显示恶性细胞中谷氨酸代谢水平最高，浸润性免疫细胞中谷氨酸代谢活性最低（图12A-B）

2、58个标本的腺癌细胞收集并定义为10种细胞类型，检测谷氨酰胺代谢关键调控因子的表达，T淋巴细胞的Gln代谢最为活跃。在GSE117570数据集中，Gln代谢的关键调控因子在多种T细胞中显著过表达，表明浸润性T细胞中Gln代谢相对活跃。在单细胞测序数据（GSE99254）中，耗尽的CD8 T细胞和抑制的Treg表达最活跃的谷氨酰胺代谢（图12C-J）

十、EPHB2是其中的关键基因

1、EPHB2在LUAD标本中高表达，EPHB2高表达组的患者比EPHB2低表达组的患者总生存率更差。Gln剥夺的培养基显著下调了EPHB2的表达。（图13A-D）

2、敲除EPHB2显著抑制了PC9细胞的增殖，细胞克隆数也明显减少。EPHB2的下调显著降低了PC9细胞的侵袭情况；EPHB2基因敲低也促进了PC9细胞的迁移（图13E-I）

3、Gln的去除显著上调了PC9细胞中PD-L1的表达（图13J）

4、敲除EPHB2转录组测序结果显示296个上调基因和269个下调基因，GO和KEGG富集分析显示，EPHB2主要与细胞通信、细胞代谢过程、免疫调节等过程相关，TNF信号通路、MAPK等通路调控相关。并且，实验表明EPHB2被敲除时，AKT通路和ERK通路下调。（图13L-M）

5、在EPHB2基因敲低后，有11个关键的Gln代谢相关基因表达下调（图13N）

十一、EPHB2对TME免疫细胞浸润的影响

1、使用NSCLCs单细胞测序数据，EPHB2主要富集于M0和M2巨噬细胞中。EPHB2在M0巨噬细胞中的表达与浸润的M2巨噬细胞的丰度呈显著正相关，提示EPHB2可能参与了M2巨噬细胞的极化（图14A-D）

2、M2巨噬细胞中EPHB2的表达与活化的NK细胞和静息状态下的NK细胞的丰度呈负相关；M2巨噬细胞与其他免疫细胞的相互作用最为广泛；此外，还研究了M2巨噬细胞和静息NK细胞之间的配体-受体相互作用（图14E-I）

3、与M0巨噬细胞相比，M2巨噬细胞显示EPHB2显著上调，同时M2标记物显著上调；Gln剥夺显著下调了M0巨噬细胞中EPHB2的表达，但不影响M2巨噬细胞的表达；EPHB2与M2巨噬细胞标记物CD206在LUAD组织中显著共表达（图14J-L）

研究总结：
本研究建立了一种新的Gln代谢定量预测肺癌预后和免疫治疗效果的系统。对肿瘤微环境(TME)中谷氨酰胺代谢进行了表征，并确定了谷氨酰胺代谢相关基因用于靶向治疗。与其他细胞相比，TME中的肿瘤细胞表现出最活跃的Gln代谢，进一步对TME中Gln代谢进行了表征，并对Gln代谢相关基因EPHB2进行了研究，为以Gln代谢为靶点的抗肿瘤策略提供了理论框架。