一、导读
细胞壁多糖在重金属结合方面起着至关重要的作用，这有助于植物体内重金属的解毒。然而，目前有关于钒（V）与植物根系细胞壁结合的分子机制的研究目前还没有，尤其是有关于对水稻（Oryza sativa L.）的研究。本研究以两个不同V耐受程度的水稻品种为研究对象，探究了不同V浓度对V的亚细胞分布的影响，揭示了细胞壁多糖对V暴露的调控机制。
结果表明，水稻根系抑制了V的向上迁移，V在根系细胞壁中的积累量达到了总V浓度的69.85-82.71%。此外，细胞壁中的半纤维素-1（HC-1）在耐受和敏感品种中分别占细胞壁结合V的67.72%和66.95%。基于FTIR光谱，本研究证明了在V胁迫下重塑了植物的细胞壁多糖。在V胁迫下，耐V水稻中所生成的果胶高达19.3%、半纤维素-1（HC-1）高达40.9%、半纤维素-2（HC-2）高达49.34%，这些均高于V敏感品种。参与多糖合成的基因--UGDH、UGE和AXS，在耐V水稻中的表达量高于V敏感水稻，该结果可为植物修复和粮食安全保障提供新的见解。
原名：The role and its transcriptome mechanisms of cell wall polysaccharides in vanadium detoxication of rice
译名：细胞壁多糖在水稻钒解毒中的作用及其转录组机制
期刊：Journal of Hazardous Materials
IF：10.588
发表时间：2022年3月
通讯作者：涂书新
通讯作者单位：华中农业大学资源与环境学院
二、实验设计
三、结果
1. 水稻幼芽和根中钒（V）的含量
两种水稻基因型中钒（V）的积累与外加V浓度之间呈正相关关系，与地上部分（幼芽）相比，根系中V含量更加明显（表1）。在80 mg L-1的V胁迫下，近93%的V含量沉积在水稻根系中。
此外，耐V水稻根系中V的含量高于V敏感植株根系中V的含量（P＜0.05）（表1）。附表S2显示两个水稻品种的V含量差异显著。在80 mg L-1的V胁迫下，耐V水稻根系中V的含量可达1355.55 μg g-1，而V敏感水稻根系中V的含量为1075.70 μg g-1。值得注意的是，在较高的V毒性（＞20 mg L-1 V）下，V的吸收减少而V的转运升高。随着V浓度的增加，生物富集因子（BCF）分别从V耐受植株和V敏感植株的45.08和42.17下降至18.09和14.44。此外，V耐受植株和V敏感植株中的转移因子（TF）在在30 mg L-1 V时分别降低至0.4610-1和 0.4710-1，随后反弹至0.6710-1（V耐受）和0.7410-1（V敏感）（表1）。
表1.V处理植株30天后，水稻植株地上部分和根部V的含量。
注：数据以平均值±标准差的形式表示，不同字母表示在0.05水平上具有显著性差异，T代表V耐受植株，S代表V敏感植株。
2. 水稻根系中V的亚细胞分布
根细胞壁是处理后的水稻植株中V的主要沉积汇，其次是可溶性部分和细胞器（图1；表2）。
细胞壁结合的V的含量超过根细胞总V含量的60-80%。随着外加V浓度的提升，尽管细胞壁结合V的含量显著升高，但V耐受植株和V敏感植株中V的比例分别从81.3%和82.7%下降至69.9%和74.1%。此外，当V浓度超过10 mg V L-1时，V耐受植株中细胞壁和可溶性组分中V的含量和比例始终高于V敏感植株（表2，附表S2）。
表2.V耐受和V敏感水稻根系的亚细胞组分中V的含量
注：数据以平均值±标准差的形式表示，不同字母表示在0.05水平上具有显著性差异，T代表V耐受植株，S代表V敏感植株。
3. 多糖组分中V的含量
根细胞壁的多糖进一步分为果胶、半纤维素-1（HC-1）、半纤维素-2（HC-2）和纤维素，值得注意的是，随着V浓度的增加，所有多糖组分中V的含量均显著升高（表3；S2）。其中，HC-1组分中的V含量最大，在耐受型植株中为61.31%-67.72%，在敏感型植株中为59.28-66.95%（图2）。随后是果胶和HC-2，其含量分别为14.26-20.71%、15.15-23.80%（V耐受植株）和14.54-19.12%、14.02-17.38%（V敏感植株）。然而，在纤维素组分中研究者仅测得到2.64%的V。值得注意的是，HC-1组分中V的比例在低浓度时逐渐增加（≤30 mg L-1），而在高浓度时略微降低（图2）。此外，在所有处理中，耐V植株HC-1组分中V的含量均显著高于V敏感植株。
表3.根细胞壁四个多糖组分（果胶、HC-1、HC-2、纤维素）中V的含量。
注：数据是平均值±SD（n=3）；不同V处理之间和2个水稻品种之间，根据双向方差分析和邓肯多重比较，不同字母之间存在显著差异（P＜0.05）。T，耐V品种；S，V敏感品种。
4. V胁迫下细胞壁中多糖含量的变化
通过测定果胶和半纤维素多糖的含量，研究者进一步验证了V毒性对多糖的影响（图3）。通过研究发现，两个供试水稻品种的果胶和半纤维素多糖含量随着V浓度的增加而逐渐增加，与对照相比，V耐受植株和V敏感植株根系中果胶的含量分别增加了10.4-19.3%和9.5-14.6%；HC-1含量分别升高18.4-40.9%和16.4-36.6%；HC-2含量分别升高21.77-49.34%和18.88-47.60%。而当V浓度达到40 mg L-1时，果胶和半纤维素的增加逐渐达到极限。在V浓度大于20 mg L-1时，V耐受植株的根细胞壁比V敏感植株的根细胞壁能够生成更多的果胶和HC-1（图3，附表2）。
5. 傅里叶红外光谱（FTIR光谱）分析
基于FT-IR光谱，研究者对细胞壁进行了进一步的分析以得到V胁迫下的细胞壁更详细信息（图4）。在1730 cm-1（峰10）、1651 cm-1（峰9）、1380 cm-1（峰6）、1154 cm-1（峰3）和1053 cm-1（峰1）区域可以观察到肉眼可见的峰形变化。
先前的研究曾表明，
- 1730 cm-1处的峰可能归因于酯羰基（-COOR）中C=O的伸缩振动，其通常来自高度甲基酯化的果胶。
- 1651 cm-1处较宽且变化的吸收峰（峰9）与蛋白酰胺I条带（C=O振动）相关，这表明V毒性也诱导了细胞壁蛋白的变化。
- 1380 cm-1附近的条带（峰6）归因于果胶COO-基团的对称伸缩。
- 1154 cm-1（峰3）的变化参与了纤维素和半纤维素中C-O-C的振动。
- 此外，在1053 cm-1（峰1）处观察到的曲线伸缩对应于纤维素和半纤维素中可溶性糖和纤维素糖链的C-C或C-OH振动。因此，这些官能团可能是水稻根细胞壁中V结合的原因。
1800-1000 cm-1波长内的同步和异步2D-FTIR-COS图谱说明了细胞壁多糖对V胁迫的响应（附图S1）。在同步图谱中可以发现，在1730 cm-1、1651 cm-1、1380 cm-1、1154 cm-1以及1053 cm-1波长处存在明显的自有峰。通过分析异步图中的交叉峰，研究者可以进一步了解到控制V结合的多糖相关官能团的改变。根据Noda’s规则，V耐受型水稻根细胞壁的反应顺序为1053＞1651≈1154＞1380＞1730 cm-1，而V敏感型水稻则为1651＞1730＞1380≈1154≈1053 cm-1。这些结果证明，在耐V水稻根细胞壁中，半纤维素C-C或C-OH对V胁迫的响应最快，其次是蛋白C=O和半纤维素C-O-C，然后再是果胶-COO-和C=O。但在敏感品种中，蛋白酰胺I带对V胁迫的反应最快，其次是果胶中的C=O和-COO-伸缩振动；最后是C-O-C、C-C、和半纤维素中的C-OH。综上所述研究者发现，半纤维素更容易在耐受水稻中与V结合。
6. 转录组测序
随后，研究者从2个水稻品种（对照和20 mg L-1 V胁迫）根部选取4个RNA样品进行测序并构建cDNA文库。在V胁迫下，研究者从V耐受和V敏感品种中，分别生成了53.88和52.25 Mb的原始reads，在对照样品中分别生成了51.09（T）和53.88 Mb（S）的原始reads。经过质检过滤后，在处理样本中共获得45.02（T）和44.11 Mb（S）的clean reads；在对照样本中共获得42.42（T）和44.74 Mb（S）clean reads。所有样本的Q20%均超过97%（表4）。平均基因组mapping率为77.00%，平均基因mapping率为74.62%。研究者从RNA-Seq结果中检测到30389个基因，平均长度为2064.159 bp。
表4.转录组数据概述。
7. 单基因的功能注释
研究者分别在T_CK vs. T_V和S_CK vs. S_V中识别出7887和5981个DEGs（表S3）。其中，T_CK vs. T_V和S_CK vs. S_V之间共享了2336个DEGs，T_CK vs. T_V特有5551个DEGs，S_CK vs. S_V特有3645个DEGs（图5A）。共有5198和4671个unigenes分别在V耐受与对照的比较和V敏感与对照的比较中表达上调，而下调的基因数量分别为2689个和1310个（图5B）。
基于gene ontology（GO）数据库进行注释，研究者对所有DEGs的功能有了基本的了解（图6）。其中，分别有6146个（V耐受型）和4504个（V敏感性）unigenes被分为生物过程、分子功能和细胞组分三类。基于在0.05水平上进行检验，研究者进一步确定了显著富集的GO terms。
- 在生物过程中，“代谢过程”（GO：0008152）、“细胞过程”（GO：0009987）和“单生物体过程”（GO：0044699）是T_CK vs. T_v和S_CK vs. S_v中富集最多的GO terms。
- 在细胞组分中，两个比较组的大多数DEGs均被注释到“细胞”（GO：0005623）、“细胞部分”（GO：0044464）、“细胞器”（GO：0043226）和“膜”（GO：0016020）等。
- 根据分子功能，从耐受型与对照组的比较和敏感型与对照组比较中获得的DEGs主要富集在“催化活性”（GO：0003824）和“结合”（GO：0005488）。此外，在T_CK vs. T_V中映射到这些GO terms的基因数量高于S_CK vs. S_V。
8. 基于KEGG通路分析对参与多糖生物合成的基因进行鉴定
为了探索水稻根系中最显著的生物学过程，研究者分别将耐受型和敏感型中的约8064和4609个unigenes注释到19条通路途径中（图7）。最具代表性的KEGG功能类别是全局和概述图谱（global and overview maps），其次是碳水化合物代谢、翻译、单向转导、折叠、分选和降解以及其他次生代谢的生物合成（图7）。“碳水化合物代谢”亚类包含15条通路（图8）。在这些途径中，研究者在V耐受型和V敏感性品种中分别注释了参与淀粉和蔗糖代谢的187个和128个unigenes，以及参与乙醛酸和二羧酸代谢的67个和34个unigenes。耐V水稻中有95个unigenes参与多糖生物合成，而V敏感水稻中有93个unigenes参与了该过程。该多糖合成包括β-呋喃果糖苷酶（sacA）、己糖激酶（HK）、果糖激酶（scrK）、甘露糖6-磷酸异构酶（MPI）、磷酸甘露酶（PMM）、甘露糖1-磷酸鸟苷酸转移酶（GMPP）、GDP-甘露糖4，6脱水酶（GMDS）、GDP-L-岩藻糖合成酶（TSTA3）、葡萄糖6-磷酸异构酶（GPI）、磷酸葡萄糖变位酶（pgm）、UTP-葡萄糖-1磷酸尿苷酰转移酶（UGP2）、UDP-葡萄糖4-差向异构酶（GALE）、UDP-葡萄糖6-脱氢酶（UGDH）、UDP-apiose/木糖合成酶（AXS）、UDP-阿拉伯糖4-差向异构酶（UXE）和UDP-葡萄糖4，6-脱水酶（RHM）、3，5-差向异构酶/4-还原酶（UER1）、UDP-葡萄糖醛酸4-差向异构酶（UGE）（表5）。
基于鉴定耐受和敏感水稻品种碳水化合物代谢关键酶的转录组数据，研究者还概述了水稻多糖形成的潜在生物合成途径（图9）。基于FPKM方法研究者鉴定了编码负责多糖生物合成的酶的unigenes。与V敏感品种相比，编码UGE、UGDH和AXS的基因在V耐受品种的根中显著上调并表达。基于qRT-PCR方法研究者验证了上述结果（附图S2）。
表5.编码水稻品种多糖生物合成的关键酶的单基因数量。
讨论
在响应重金属暴露方面，一些植物可以在根部储存大量有毒金属，以防止在生长部位积累金属。本研究的所有处理中，水稻根系中含有的V含量远高于地上部（表1；附表S2）。在Cd胁迫下生长的小白菜、Cu处理下生长的蓖麻和Cr胁迫下生长的番茄中也观察到类似的结果。此外，与V敏感品种相比，耐V品种的根系表现出显著的V固定效应。Guo等人的研究同样发现，耐Cd小麦比Cd敏感小麦能积累更高的Cd。水稻根系V沉积量与外加V浓度密切相关。但较高的V胁迫（≥30 mg L-1）可损害根系的积累能力，随后，过量的V会向上迁移，进而危害水稻生长。
植物可以发挥金属的亚细胞分布来调控金属的运输，如细胞壁固定、金属螯合和液泡中重金属分离。根细胞壁是重金属的主要汇，其作为一种特定的屏障可以阻挡外界污染物进入内细胞。对芹菜中Cd、蓖麻中Cu和伊乐藻（Elodea nuttallii）中Hg的亚细胞分布的研究表明，根细胞壁是结合金属的主要部位。此外，本研究数据表明，大部分外加的V在根细胞中积累，其次是可溶性部分（表2；图1）。而细胞壁中的V比例随着V胁迫的增加而降低，这表明细胞壁中V固定的能力有限。在Cd底物中生长的白菜（Brassica chinensis L.）的研究中也观察到了相似的结果。此外，与V敏感型水稻相比，耐V水稻细胞壁的V捕获能力更大。这种差异可能是由于对毒性的抗性不同，例如根系对V的选择性吸收和沉积、对细胞壁的粘附和植物中不同的金属结合成分。
多糖作为细胞壁的主要成分，在金属离子结合中起着至关重要的作用。本研究将根细胞壁中的多糖组分进一步分为纤维素、HC-1、HC-2和果胶。由于果胶所携带的负电荷，其被公认为金属离子的主要结合位点。然而，近期的研究表明，细胞壁-半纤维素在结合重金属中起着关键性的作用。在本研究中，研究者发现在耐受和敏感品种中，在与细胞壁结合的这部分V中，分别有高达67.72%和66.95%的V与HC-1结合（表3；图2）。与V敏感水稻相比，随着V水平的增加，耐V水稻能够在根细胞壁中积累更多的V含量（表3；附表S2）。同样，Liu等人研究同样发现，耐Cd品种根细胞壁中的半纤维素能够比Cd敏感品种积累更多的Cd。
在植物的解毒方面，植物能够改变其本身的细胞壁多糖以应对胁迫。在本研究中，V胁迫刺激水稻根系中多糖的合成，从而结合更多的V离子（图3）。在诸如拟南芥、蓖麻以及小白菜等研究中同样观察到不同重金属能够促进多糖的合成。但细胞壁中果胶和半纤维素的合成有限，这表明细胞壁的结合能力会达到饱和。本研究中，耐受品种的多糖含量高于敏感品种（图3；附表S2）。这与其他研究结果相一致。Wang等人的报道也表明，细胞壁多糖对金属胁迫的可塑性在植物物种间甚至在同一物种的不同基因型间存在差异。
为了进一步探究V胁迫对细胞壁多糖的调控作用，研究者还进行了FTIR分析。通过分析研究者发现，V毒性诱导了几个与细胞壁官能团有关的峰发生肉眼可见的变化，如酯羰基（-COOR）、蛋白酰胺I带（C=O振动）、果胶COO-基团、纤维素和半纤维素的C-O-C、纤维素和半纤维素的C-C或C-OH（图4）。由此可以推断，V胁迫可能诱导细胞壁多糖的变化，从而影响与V的结合过程。Shi等人通过研究发现纤维素、木质素或果胶中含有-OH和-COOH等氧的官能团可能是海州香薷（Elsholtzia splendens）细胞壁中Cu的主要结合位点。此外，美洲蜚蠊（P. americana）内，诸如羧基、-OH、-C=O、-C-O在内的有机官能团可能在与Mn结合中起到关键的作用。细胞壁蛋白的变化可能是由于糖蛋白涉及的细胞壁延伸所致。与细胞壁结合的V的一部分可能来自V与蛋白质的粘附。结合异步图中的交叉峰（附图S1），研究者可以进一步知道，半纤维素结合更容易在耐受水稻中与V结合，这可能与耐V品种较高的多糖合成并与V结合有关。
尽管有报道称细胞壁中的多糖在与有毒金属相结合中起着举足轻重的作用，但在应激条件下，有助于其合成的分子和遗传机制仍缺乏表征。为了进一步鉴定V胁迫下编码多糖合成的关键酶的基因，研究者对水稻根系进行了转录组学分析。每个样本产生了约6.58 GB的数据量。所有样本的Q20百分比均超过97%。平均基因组mapping率为72.36%，平均基因mapping率为69.13%（表4）。这些结果表明研究者的转录数据具有较高的质量和可分析性。
与对照组相比，应激响应是两种植株（V耐受和V敏感品种）中上调的基因中显著富集的GO terms，但V耐受与对照组相比其基因数量更多，这表明细胞对V应激的响应更强（图6）。再者，代谢通路的KEGG富集表明V胁迫下耐V水稻细胞壁调控活跃（图7）。映射到代谢通路的DEGs主要富集在“淀粉和蔗糖代谢”和“氨基糖和核苷酸糖代谢”途径。在淀粉和蔗糖代谢中，研究者从V耐受和V敏感植株中分别获得了130个和103个上调的DEGs，进一步揭示了V胁迫诱导了参与重金属结合所需的细胞壁多糖的生物合成。
KEGG注释的分析确定了参与多糖生物合成途径中的18种关键酶，这些关键酶包括sacA、HK、scrK、MPI、PMM、GMPP、GMDS、TSTA3、GPI、pgm、UGP2、GALE、UGDH、AXS、UXE、RHM、UER1和UGE（表5）。这些结果表明，相比与V敏感水稻，在V胁迫下，unigenes编码的UGDH、UGE和AXS的表达在V耐受水稻中显著富集，这可能是不同遗传型植株对于V解毒的关键机制（图9）。许多研究提供的证据表明，UGDH、UGE和AXS是多糖生产的关键调节因子。UGDH催化UDP-Glc转化为UDP-GlcA；随后，UGE通过NAD+依赖性氧化还原化学修饰UDP-GlcA产生UDP-GalA，AXS催化UDP-GlcA转化为UDP-D-apiose和UDP-D-木糖的混合物。生化证据表明UDP-GlcA在果胶生物合成中起关键的作用，UDP-GalA是植物果胶多糖的显著糖残基。在半纤维素合成过程中，合成UDP-木的途径是第一步，UGDH表达的时间可能调控进入半纤维素的流量。本研究中，这些酶的表达水平可能决定了V胁迫下多糖的积累。对这些unigenes的表征可能为未来研究重金属胁迫下参与多糖生物合成的其他重要酶奠定基础。此外，还需要更多的研究来探究这些基因的表达及在不同浓度下在植物内部与V之间的相互作用关系。
结论
综上所述，本研究表明，HC-1截留了最大含量的V，抑制了V的向上运输，从而减轻了V胁迫对水稻品种的影响。比较结果表明，耐V水稻由于多糖含量较高，具有在根部固定V的能力更强。此外，V胁迫可能刺激多糖合成，影响多糖中的与V的结合过程。水稻根系的全面RNA-Seq分析鉴定出参与多糖生物合成的18种关键酶。编码UGDH、UGE和AXS的上调基因在耐V水稻中的表达量高于V敏感水稻。此外基于qRT-PCR方法研究者验证了RNA-Seq分析的准确性。
