Association of aging-related genes with prognosis and immune infiltration in pancreatic adenocarcinoma
衰老相关基因与胰腺癌的预后和免疫浸润的关系
发表期刊：Front Cell Dev Biol
发表日期：2022 Aug 8
影响因子：6.081
DOI: 10.3389/fcell.2022.942225
一、研究背景
作为一种致命的恶性肿瘤，胰腺癌（PAAD）仍然是全球癌症相关死亡的第四大原因。衰老，被认为是生理完整性的逐渐中断，一直是癌症发展的关键风险因素。老年人在癌症患者中占很大比例，癌症已成为60-79岁人群的第一死因。衰老和癌症之间的相互作用已被广泛研究。与衰老相关的DNA损伤、氧化应激和衰老相关的分泌物表型分泌的积累，有助于最初的肿瘤发生。衰老引起的免疫功能下降也导致了癌症发病率的增加。
二、材料与方法
1、数据来源
1） PAAD患者的RNA测序数据和相关的临床特征从癌症基因组图谱（TCGA）、基因型-组织表达项目（GTEx）、基因表达总库（GEO）和国际癌症基因组联盟（ICGC）获得
2） ARG列表来自人类老龄化基因组资源（HAGR）
3） 免疫组化结果来自人类蛋白质图谱（HPA）
2、分析流程
1） 识别具有预后能力的差异表达的衰老相关基因：肿瘤样本（n = 178）和TCGA（n = 4）和GTEx（n = 167）数据集的正常样本之间进行差异分析;以衰老相关基因（ARG）与差异表达基因（DEGs）的交集为基础，选择差异表达的ARG参与单变量Cox回归分析，以确定预后的ARG。
2） 分子亚型的分析: 利用 "ConsensusClusterPlus "R软件包将TCGA数据集中的177名患者分为两个群组; CIBERSORT; 调查了预后性ARG与PD-L1的相关性; 探讨了两个分子亚型中八个ARG的表达和临床特征
3） 衰老相关基因风险特征的构建和验证：来自TCGA队列的PAAD患者（n = 177）参与训练集，而GSE57495（n = 63）和ICGC-PACA-AU（n = 80）被选为验证集；采用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归分析来探索与OS最紧密相关的关键ARG
4） 风险分数与分子亚型、免疫分数和临床病理学特征的关系：单变量和多变量的Cox回归分析；构建nomogram图；计算ImmuneScore
5） 识别受衰老相关基因影响的免疫微环境：XCELL、TIMER、QUANTISEQ、MCPOUNTER、EPIC、CIBERSORT-ABS和CIBERSORT
6） 风险特征与信号通路、肿瘤突变和化学敏感性的相关性：基因组变异分析（GSVA）；使用GeneMANIA来确定关键ARG的功能相似基因及其关系；评估了风险分数与TMB的相关性；使用R软件包 "pRRophetic "调查了两个风险组的治疗半抑制浓度（IC50）
7） 衰老相关基因的表达水平验证和生存分析：从HPA获得参与风险特征的ARG的免疫组化结果，以验证ARG在正常和肿瘤组织中的表达；通过RT-qPCR验证了两个关键ARG在正常胰腺细胞系HPNE和两个胰腺癌细胞系PANC1和CFPAC1中的表达
三、实验结果
01 - 识别预后衰老相关基因，构建分子亚型
根据TCGA和GTEx数据集，共选择了1589个正常和肿瘤样本之间的DEGs，并在火山图中显示出来（图2A）。此外，从这些DEGs中获得了24个ARGs，热图显示了它们的差异性表达（图2B）。实施了单变量的Cox回归分析，得到了8个具有预后价值的ARG（图2C）。PTGS2、TOP2A、IGFBP3、HOXB7和PLAU具有危险性，而BSCL2、UCP2和FGFR1具有保护性。
通过共识聚类，以最高聚类稳定性为标准，将TCGA队列中的PAAD患者分为两个分子簇（图3A）。与集群2（n = 119）相比，集群1（n = 58）的OS较低（图3B）。此外，作者评估了每个簇的免疫浸润情况（图3C）。Naive B细胞、浆细胞、CD8 T细胞和单核细胞在集群2中浸润较高，而集群1拥有较高的M0巨噬细胞和活化树突状细胞浸润。簇1中PD-L1的表达较高（图3D）。TOP2A和PLAU与PD-L1呈正相关，而HOXB7与PD-L1之间呈负相关（图3E）。此外，热图描述了预后衰老相关基因的表达和两个群组的临床特征（图3F）。进一步比较了两个分子亚型之间的临床特征，发现集群1拥有更高的等级，以及肿瘤的晚期和TNM分期（图3G）。
02 - 衰老相关基因风险特征的开发和验证、nomogram的建立
基于TCGA数据库，8个预后相关ARG被纳入LASSO回归分析（图4A，B）。最后，确定了七个ARG用于构建风险签名。通过各ARG表达量之和乘以各ARG系数来计算风险评分，并将TCGA队列中的PAAD患者按风险评分中值分为两个风险亚组（图4C）。散点图显示了根据风险评分的患者的生存率（图4D），热图进一步说明了两组之间7种ARG的不同表达（图4E）。高危组拥有较差的OS（图4F）。与时间相关的ROC曲线验证了风险特征在1、2和3年的精确性（图4G）。
所有上述结果都在GSE57495（图5A-E）和ICGC-PACA-AU（图5F-J）中得到验证。综上所述，我们的ARG风险特征可以精确预测PAAD患者的生存结果。
作者探讨了风险特征是否对TCGA队列中的PAAD患者具有独立的预测价值。单变量Cox回归分析（图6A）和多变量Cox回归分析（图6B）共同证明了这一点。多个ROC曲线验证了其与其他临床因素相比的预测稳定性（图6C）。为了便于临床使用，构建了一个将风险分数与年龄、性别、等级和阶段相结合的提名图（图6D）。III-IV期患者（n = 177中的7名）由于结果的异质性而被排除在外。绘制了校准曲线，我们的列线图在1年、2年和3年内的精确度得到了很好的确认（图6E-G）。
03 - 评分与分子亚型、ImmuneScore和临床病理学特征的相关性
热图直观地显示了基于TCGA队列的ARG表达、风险评分、集群亚型、ImmuneScore和临床因素之间的关联（图7A）。发现风险评分和ImmuneScore以及群组之间有明显的相关性。高风险评分的PAAD患者在群组1中占很大比例，并且拥有较低的ImmuneScore。为了验证，探讨了PAAD患者在不同组中的风险分数。与上述结果一致，来自群组1（图7B）和低ImmuneScore亚组（图7C）的患者保留高风险分数。有趣的是，3-4级（图7D）或肿瘤（T）3-4期（图7E）的患者也拥有高风险分数。
由于高危组的PAAD患者取得了较低的ImmuneScore，作者根据TCGA队列对其免疫微环境进行了详细分析。通过不同的测试证实，风险评分与M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、中性粒细胞和癌症相关成纤维细胞（CAF）呈正相关，而NK细胞、CD8 T细胞、CD4 T细胞和B细胞与风险评分呈负相关（图8A）。免疫评分、基质评分和微环境评分也与风险评分呈负相关，表明高危组的免疫微环境很糟糕。此外，还对免疫检查点基因的表达进行了分析。TNFSF4、TNFSF9、CD80、CD70、CD44、CD274（PD-L1）和CD276的表达与风险评分呈正相关，而其他重要的相关性是负相关（图8B）。这些明显的相关性可以为ICI在PAAD的临床治疗中提供选择。
04 - 潜在途径、肿瘤突变和IC50的分析
为了探索与风险评分相关的潜在途径，作者进行了GSVA。与PAAD发展有关的几个途径，如WNT、VEGF、MTOR和MAPK途径与风险评分呈正相关，而p53途径与风险评分的关系最为密切（图9A）。通过GeneMANIA发现共有20个与关键ARG共同表达的功能相似的基因（图9B）。在849名PAAD患者中研究了7个关键ARG的突变，发现其中62人（7%）有突变（图9C）。PTGS2突变占比最大，扩增是基因改变的主要形式。然后分析了两个风险组中前20个基因的突变情况。肿瘤图显示，高危组保留了较高的基因突变（图9D,E）。此外，我们现高危组的TMB更高（图9F）。生存分析表明，与高风险组中TMB较高的患者相比，TMB较低的患者得到更好的OS（图9G）。最后，探讨了风险特征预测几种药物对PAAD的化学敏感性的能力。根据pRRophetic算法的预测，高风险组的患者可能对顺铂（图9H）和达沙替尼（图9I）更敏感，而阿西替尼（图9J）和伏立诺他（图9K）可能是低风险组的更好选择。
05 - 衰老相关基因的蛋白质和mRNA表达水平及生存分析
为了验证ARG在正常和肿瘤组织中的表达，作者获得了HPA的免疫组化结果。除IGFBP3在HPA中没有发现外，PTGS2（图10A，B）和TOP2A（图10C，D）的蛋白表达在胰腺肿瘤组织中较高，这与它们和PAAD患者的不良生存率的相关性一致。BSCL2（图10E,F）、FGFR1（图10G,H）和UCP2（图10I,J）在正常胰腺组织中表达较高，它们的高表达与更好的生存结果有关。值得注意的是，根据TCGA和GTEx，UCP2在肿瘤样本中表达较高，这与它的免疫组化结果相反，确切的结果应该在一个大的队列中进一步验证。PLAU（图10K,L）在正常和肿瘤组织中都有较高的表达，但它与较差的OS的关系与我们之前发现的一致。最后，验证了正常和肿瘤胰腺细胞系中关键ARG的表达。与HPNE相比，BSCL2在PANC1和CFPAC1中表达较低（图10M），而TOP2A表达较高（图10N）。
四、结论
作者确定了两种分子亚型，并建立了一个基于ARG的新型ARG风险签名。根据签名产生的风险评分，预测了PAAD患者的预后、免疫微环境、肿瘤突变和药物敏感性。本研究可能为PAAD的分子机制提供新的理解，并为PAAD的临床治疗提供新的目标和选择。
