早产（preterm）是指妊娠满28周至不足37周间分娩者。此时娩出的新生儿称早产儿，体重1000～2499g。国内早产占分娩总数的5%～15%。约15%的早产儿死于新生儿期。近年来由于早产儿治疗和监护手段的进步，其生存率明显提高，伤残率下降。国外学者建议将早产定义时间上限提前到妊娠20周。

预防早产最主要的就是尽早识别出有早产风险的准妈妈，进行干预治疗。而在众多的临床表现中如何找出合适的指标来识别早产风险呢？斯坦福大学统计系2015年发表在PNAS上的文章（引用182次）也许可以为这个冰冷的问题带来一丝阳光。

16S rRNA gene | pregnancy | preterm birth | microbiome | premature labor

都有哪些结论？

Materials and Methods

• 妊娠期间宝妈妈阴道，肠道，唾液和牙齿/牙龈细菌群落的多样性和组成相对稳定。
• 妊娠期宝妈妈阴道微生物有五种主要的分型（CSTs）：

1. CST 1：卷曲乳杆菌占优势(Lactobacillus crispatus-dominant);
2. CST 2，加氏乳杆菌占优势(Lactobacillus gasseri-dominant);
3. CST 3，乳酸杆菌属占优势(Lactobacillus iners-dominant)；
4. CST4，群落多样性(diverse community);
5. CST 5，简氏乳杆菌占优势(Lactobacillus jensenii-dominant)。
   其他身体部位的妊娠相关微生物群落（肠道，唾液和牙齿/牙龈）不能由少量不连续的CST代表。

• 妊娠期宝妈妈阴道微生物组CST既有稳定性又有强烈变化。

• 高度多样性的微生物组（CST4）与早产相关。

• Gardnerella和Ureaplasma Abundance 可为宝妈妈早产风险的一个指标。

• 第二组（validation dataset ）九名准妈妈验证了早产风险因素。

• 分娩往往伴随着宝妈妈阴道微生物组群落结构的剧烈变化。

都是怎么实现的？

Fig. 1.

人类相关的细菌群落在怀孕期间是稳定的。基于discovery datase
40位女性所有身体部位的数据，α多样性每周不稳定性（受试者中每周的变化）和β多样性与妊娠时间的估计趋势无关（P> 0.05）。
（A）对于从阴道，粪便，唾液和牙齿/牙龈采集的标本，将 Shannon diversity与妊娠时间作图。蓝线表示按受试者分组时按多样性的线性混合效应回归。阴影表示95％置信区间（CI）。由于阴道微生物多样性和稳定性数据高度离散，所以在拟合以改善正常性之前对它们进行了对数转换。【t test】
（B）相隔一周的相同受试者样本之间 Weighted-UniFrac 距离针对妊娠时间绘制。红线表示lme回归，阴影区域表示95％CI。【t test】
（C）将相同孕周内取得的不同受试者样品之间的平均加权UniFrac距离与妊娠时间作图。绿线表示线性拟合，阴影表示通过置换bootstrap估计的95％CI。【permutation test】

Fig.2

对属于第一个组的40名准妈妈从每个身体部位微生物进行了NMDS对Bray-Curtis距离的排序。 从早期（孕周14-21）和晚期（孕周28-35）采样时间点绘制等高线。 这些轮廓明显重叠，表明妊娠早期和晚期的微生物组成并没有显着差异。

Fig.3

线性拟合显示产前（红色）产后（蓝色）宝妈妈微生物多样性指数变化： vaginal communities（P = 5.2×10-6配对Wilcoxon检验），to a lesser extent, in the tooth/gum communities (P = 0.014) but not in saliva or stool.

• 什么叫community state type (CSTs)?
  基于一定的算法对物种-样本矩阵进行聚类，得到聚类结果，每一个类命名为一个CSTs.是一种对微生物群落结构分型的方法。

本文用到的是（R包cluster）：
de novo clustering
the partitioning around medoids algorithm

具体步骤：

1. use a non-phylogenetically aware distance measure so as to be able to separate these species. Start with an MDS (or PCoA) ordination
2. Denoise distance matrix
3. Determine number of clusters（gap statistic）
4. Cluster into CSTs
5. Evaluate clustering（ MDS and NMDS ordinations）
6. Plot heatmap colored by CST

Fig.4

宝妈妈阴道微生物物种丰度最高的前20个种，用k-medoids聚类算法确定了5个CTS。CSTs 1,2,3和5的特征在于优势乳酸杆菌属物种，其通常占群落> 90％，分别为卷曲乳杆菌，简氏乳杆菌，黑色乳杆菌和加氏乳杆菌。 CST4 多样性高。 宝宝出生时间由顶部的栏指示：分娩（灰色），> 37孕周；早产（褐红色），<36周； 非常早产（粉红色），<32周； 第37周（白色）。

Fig.5

（A）来自第一组的40位受试者的阴道CST时程。颜色表示图例中所示的CST;黑括号表示生产日期。受试者P1-P7早产（孕37周前）;受试者M1-M5被认为是边缘的（孕37周）;在孕期（> 37孕周）生产受试者T1-T28。
（B）阴道CSTs的动态被近似为一个马尔可夫链，具有CST之间不依赖于分组的转换概率。箭头权重与状态之间的每周转换概率的最大似然估计成比例。节点的大小随着CST出现的数量而变化。颜色表示与早产关联的强度。自我转换概率用数字表示。转移概率是所有连续采样的4-10天分离样本对的最大似然估计值。

Fig.6

在第一组40名准妈妈中，高度多样性的CST4与早期分娩和早产的可能性相关。 （A）分娩时的孕龄对33名受试者中分配给高多样性CST 4阴道标本的分数绘图, 虚线表示线性拟合。 CST4的增加与早期分娩显着相关（P = 1.1×10-4，Pearson; P = 0.0147，Spearman）。 （B） 在怀孕期间随时收集的CST 4标本与早产比例较高有关。

fig.7

在测试数据集中评估了发现数据集中确定的高风险阴道微生物群落由CST4加上高丰度Gardnerella或Ureaplasma组成。 测试数据集包括从第二组（n = 9，其中4个早产儿）收集的246个阴道样品的基于Illumina的序列。
对于此分析，使用低乳酸杆菌相对丰度（<75％乳酸杆菌）作为CST4的替代指标。 所有这样的“CST 4”样品都评估了Gardnerella and Ureaplasma丰度，并通过相对丰度的正则化对数作图。 在CST 4的4名受试者中，早产的两名受试者具有高Ureaplasma丰度（受试者10530），或高Ureaplasma和高Gardnerella丰度（受试者10542）。 因此，只有在早产的受试者中才发现低乳酸杆菌丰度加Gardnerella or Ureaplasma 的组合。

为什么是Gardnerella or Ureaplasma ？

用第一组 (n = 40) 宝妈妈阴道样品单个微生物丰度与早产与否作相关性分析。考虑到样本的独特性，作者分析了两种极端情况，并参考已发表的与早产相关微生物物种。检验分析得出高丰度的Gardnerella or Ureaplasma与宝妈妈早产相关。

对应原文如下：

We tested CST 4 samples from the first group of subjects (n = 40) for associations between the relative abundances of individual taxa and preterm delivery. The nonindependence of samples from the same subject, combined with heterogeneity in the number and timing of samples from different subjects in our study, complicated this comparison.Therefore, we tested under the two extreme but contrary models of sample dependenc —complete sample independence and complete dependence of samples within subjects—with the recognition that these two models bound the actual solution.

When CST 4 samples were treated independently, both Ureaplasma (Padj = 5 × 10−34, Benjamini–Hochberg–corrected Wald test) and Gardnerella (Padj = 1.5 × 10−13) had strong positive associations with preterm birth.

When CST 4 samples within subjects were treated completely nonindependently (by merging the CST 4 samples from each subject before testing) only the association with Gardnerella remained significant (Padj = 0.054).Although caution is warranted because of the small number of subjects, these findings suggest that in the setting of low Lactobacillus abundance, a high abundance of Gardnerella in particular may increase the risk of preterm birth. In addition, Ureaplasma deserves further investigation as a risk factor.

都有哪些可以借鉴的地方？

• 时间序列的分析（时间是最基本的环境因子）
• 微生物群落的分型
• 用马尔科夫链表示CST之间的转化规律
• 提供可重复的分析脚本和数据
• 妊娠期间按时体检

百科经验：

1. 保持心情平静，合理饮食。
2. 定期产前检查，指导孕期卫生，积极治疗泌尿生殖道感染，孕晚期节制性生活，以免胎膜早破。
3. 加强高危妊娠管理，积极治疗妊娠合并症和并发症，预防胎膜早破和亚临床感染。
4. 宫颈内口松弛者，妊娠14～18周行宫颈内口环扎术。

Digiulio D B, Callahan B J, Mcmurdie P J, et al. Temporal and spatial variation of the human microbiota during pregnancy[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2015, 112(35):11060.
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