hello，大家好，今天周日，太原出现了新的疫情，再次被封，父母也都在家，介绍的好姑娘，见的机会也推迟了，那我们该怎么办呢？？只好看看文献，好好学习了。
今天我们要继续分享空间转录组的分析内容，之前大部分都是分享的空间转录组需要和单细胞联合分析，但是越来越多的研究已经发现，空间转录组本身无穷的魅力已经能够解决大部分的问题，今天分享的文章在Spatial CRISPR genomics identifies regulators of the tumor microenvironment，2022年3月发表于Cell,开发了一种新的空间功能基因组学方法——“扰动图谱（Perturb-map）”，结合CRISPR库、多重成像和空间转录组学，以识别肿瘤组成、组织和免疫的遗传决定因素，从而在保留了空间结构的同时，以单细胞分辨率为组织内的功能基因组学建立了Perturb-map，并为癌细胞的TGFβ反应性如何影响TME提出了新的见解。又是一篇高分文献，科研工作者的努力研究成功一方面成就了自己，一方面也给10X打了不错的广告，我还是希望国产平台能够崛起。
肿瘤的细胞组成、空间结构和组织定位对癌症的进展和治疗反应有着重要的影响，而这些因素与肿瘤免疫尤其相关，因为肿瘤微环境(TME) 内的免疫细胞组成和定位是免疫治疗反应和患者预后的主要决定因素之一。空间分辨的单细胞基因组测序结果表明，肿瘤附近存在着许多遗传上不同的亚克隆，并且可能具有不同的TME组成，但是，特定基因如何影响TME、相邻克隆如何互相影响的都尚不清楚。事实上，虽然目前已经发现了一些参与协调 TME 的基因，但许多基因在影响不同肿瘤的结构和免疫组成方面的潜在作用均尚未确定。
TME的组成是相当复杂的，由许多不同的免疫和非免疫细胞类型组成，它们的比例、位置和运动都是相互依赖的因素。许多基因的功能取决于组织的环境以及与特定细胞类型和结构的空间接近程度。此外，虽然CRISPR筛选有助于发现调节许多细胞内在过程的基因，但是现有方法对于识别细胞外的基因功能并不理想，尤其是在组织环境中。因此，从肿瘤中表达的成百上千的基因中识别出会影响TME的组成和排列的基因是一个巨大的挑战。
Pro-Code系统是一种基于蛋白质的载体/细胞条形码系统，由与支架蛋白dNGFR融合的线性表位（如FLAG、HA等）的三联体组合组成。本文研究人员首先构建了表达不同Pro-Code的肺癌（KrasG12D以及p53缺失的KP肺癌）和乳腺癌（4T1）细胞系，以此构建小鼠的肺癌和乳腺癌模型，通过多重成像原位检测实现了在单细胞分辨率和组织规模下，检测到肿瘤内120种不同的 Pro-Code 表达的癌细胞群，并且显示了肺癌和乳腺癌的克隆性，证实了每种肿瘤背景的不同空间模式——KP 肺癌具有高克隆性和低混合性，4T1 原发性肿瘤具有弥漫性克隆性，4T1肺转移瘤则呈克隆性发展，但也存在混合性转移。
那么是否可以利用Pro-Code创建一个用于原位解析CRISPR筛选的平台呢？答案是肯定的，即Perturb-map——基于蛋白质条形码（Pro-Code）系统，利用少量线性表位的三重组合来创建一组更高阶的独特条形码，从而可以标记表达不同CRISPR gRNA的细胞。
研究人员构建了一个靶向35个基因的核Pro-Code（nPC）/CRISPR慢病毒载体（LV）文库，并将其应用于小鼠肺癌模型中，这些基因编码细胞因子信号通路的调节因子（包括IFNα、IFNγ、TGFβ和TNFα的受体）以及参与免疫细胞相互作用的配体和分泌因子，并且参与了与人类对癌症免疫疗法的反应相关的途径。研究人员使用 Pro-Code 鉴定来确定每个肿瘤中表达的 CRISPR，在注射了nPC/CRISPR KP 细胞的 11 只小鼠中确定了约1,750 个不同的 Pro-Code 表达肿瘤。为了确定靶基因是否影响体内肿瘤的发展，研究人员首先比较了携带特定nPC/CRISPR的肿瘤比例与预注射细胞混合物中相同nPC/CRISPR的相对频率。结果显示许多 nPC/CRISPR 的频率发生了显著变化，提示相关基因影响肿瘤生长。研究人员还发现除了能够测量与基因敲除相关的肿瘤病变的数量和面积外，Perturb-map还有助于评估不同基因对肿瘤结构的影响。基于Perturb-map的结果，研究人员发现TGFβ受体2（Tgfbr2）基因和Socs1基因的敲除（KO）均具有生长优势，但是前者会导致基质重塑并诱导高纤维粘液性肿瘤的发展，而后者则与两种低分化的肿瘤病变类型——胸膜斑块和鳞状肿瘤的发生相关，由此表明Tgfbr2 和 Socs1 的缺失以截然不同的方式改变了 KP 肺肿瘤的结构。
随后，研究人员又证实，利用Perturb-map可以研究不同基因对肿瘤病灶内和周围免疫细胞的的招募和维持的影响。以在体内均富集的Tgfbr2 KO和Socs1 KO损伤为例，两者显示出相反的免疫组分模式，Tgfbr2病灶明显排除免疫细胞，尤其是CD4+和CD8+ T细胞，而Socs1病灶则表现出高度T细胞浸润。除了量化免疫浸润外，Perturb-map还可以用于评估每个肿瘤病灶内免疫细胞的空间分布。一般来说，免疫细胞更集中在肿瘤的外部区域，尤其是 CD4+和CD11c+ 细胞，然而，研究人员发现在特定的KO病变中存在显著差异。此外，通过Perturb-map研究相邻肿瘤是否影响彼此的免疫浸润，研究人员发现，毗邻Socs1 KO肿瘤的肿瘤病灶并不倾向于显示更高的T细胞浸润，而毗邻Tgfbr2 KO肿瘤的肿瘤病灶的T细胞也没有更多地被排除，由此表明，至少在IFNγ和TGFβ通路改变的情况下，在彼此紧密接触的肺肿瘤病变中，免疫细胞的组成和空间排列是非常局部的。这些结果也证实，Perturb-map提供了一种规模化的方法来评估特定的基因改变如何影响局部、近端和远端 TME 状态。
进一步地，研究人员将空间转录组与Perturb-map配对结合，以确定不同基因扰动对肿瘤状态的影响，结果证实其可以识别与基因扰动相关的分子特征。深入分析表明，KP肺癌细胞中Tgfbr2的缺失的一个结果是肿瘤中TGFβ表达增加以及TME中TGFβ通路的激活，这提示在Tgfbr2 KO病灶中观察到的基质重塑和免疫排斥的潜在机制是肿瘤相关成纤维细胞的TGFβ的激活。由此也证实，空间转录组学整合到Perturb-map中，可以以空间分辨的方式提供不同基因扰动的无偏倚分子分析。
这个地方就是我们今天关注的重点
为了进一步确定不同基因扰动对肿瘤状态的影响，将空间转录组学与 Perturbmap 配对。将 10X Visium 技术应用于小鼠肺的四个切片，这些切片上覆盖了表达 nPC/CRISPR 文库的 KP 肿瘤。 k-means 衍生clusters的差异表达区分了与肿瘤病变相对应的空间域中的特定基因特征。与健康的周围肺组织相比，肿瘤病变高度表达特定的角蛋白和上皮标志物（例如，Krt8、Krt18 和 Epcam)。还在 KP 病变中发现了 IFNγ 特征，包括抗原呈递途径（例如，Nlrc5、Tap1、Psmb8 和 Psmb9）、IFNγ 信号通路（例如，Stat1、Irf1 和 Socs1）和 IFNg 诱导的趋化因子（例如， Cxcl9 和 Cxcl10）。值得注意的是，Pro-Code 转录本在肿瘤clusters区域内被清晰且特异性地捕获.
由 Pro-Code 转录本定义的基于图形的肿瘤点聚类揭示了肺切片中不同且重复的肿瘤基因表达特征。与 KP 肿瘤的克隆发展一致，与给定病变相对应的空间域通常聚集在一起，但也有与其他病变明显聚集的特定病变。为了识别每个病变中的基因扰动，通过成像质量流式细胞术对用针对每个 Pro-Code 表位标签的金属结合抗体染色的肺组织连续切片进行成像。组织内 nPC/CRISPR 的鉴定能够用相应的基因扰动注释每个基因特征，并揭示许多携带靶向 Tgfbr2 或 Ifngr2 的 CRISPR 的肿瘤与其他 KP 肿瘤相比呈现出不同的基因特征，如无偏聚类所示。还有一些与 KP 病变相对应的clusters，但不是特定于任何基因 KO，因此将它们标记为不同的 KP clusters（例如，KP_1-2、KP_1-3 等）。应该注意的是，由于 Visium 对每个扰动的相对较少的病变进行采样，这可能会影响为每个 KO 解析不同clusters的能力。
对每个 Visium 切片上的肿瘤clusters的基因表达进行平均，该切片包含来自单独注射的小鼠的荷瘤肺组织，然后分层聚类以揭示与特定组织区域或扰动相关的切片的一致基因特征。 位于肿瘤病变外围的空间域的特征是 Cxcl15、中性粒细胞引诱剂、Lyz2 和 Lamp3、骨髓细胞标志物的上调，以及高水平的 MHC II 类机制，包括 H2-Ab1 和 Cd74。 这与成像数据中观察到的肿瘤边界周围免疫细胞密度增加一致。 Ifngr2 KO 肿瘤表现出 IFNγ 刺激基因 (ISG) 的表达显著降低，包括 Irf1 和 Cxcl9，以及许多参与抗原呈递的基因，如 H2-k1、H2-d1、Ciita、Nlrc5、Tap1、Psmb8 和 Psmb9.
在 Tgfbr2 KO 肿瘤中，许多相同的 ISG 也被下调，可能是由于肿瘤的 T 细胞排除状态，并且各种胶原蛋白编码基因增加，包括 Col1a1、Col6a1 和 Col6a2，与存在一致 纤维粘液基质。 出乎意料的是，在 Tgfbr2 靶向肿瘤中上调的许多基因表明 TGFβ 信号增加，包括由 TGFβ 诱导的 Tnc、Timp1 和 Arg1，以及由癌症相关成纤维细胞表达的 TGFβ 诱导基因 Cald1。 弹性蛋白 (Eln) 是一种在肺成纤维细胞中被 TGFβ 高度特异性上调的基因，在 Tgfbr2 KO 肿瘤中也被上调。 受 TGFβ 负调控的 Sftpb 被下调。 值得注意的是，TGFb 受体的配体 Tgfb1 和 Tgfb3 在 Tgfbr2 病变中也上调。
在 Tgfbr2 肿瘤中诱导 TGFβ 诱导的基因促使我们测试 KP/Tgfbr2 CRISPR 细胞对 TGFβ 的反应性。 这证实了它们没有响应 TGFβ 激活 TGFβ 信号传导（通过 SMAD2/3 的磷酸化测量），并且 TGFBR2 在这些细胞中确实被功能性敲除。 因此，我们试图了解 Tgfbr2 KO TME 中的哪些其他细胞类型可能对 TGFβ 有反应。 尽管 Visium 尚未提供单细胞分辨率，但来自纯化群体的转录组数据可用于推断细胞类型反应。 为了做出这个推断，我们使用了 CytoSig 数据库。 在相关治疗和细胞类型对之间创建代表性基因集，然后进行基因集富集分析 (GSEA) 以识别不同肿瘤簇中的这些特定细胞因子特征。
Tgfbr2 KO 损伤中最丰富的基因特征对应于 TGFβ 激活的肺成纤维细胞。 尽管肺肿瘤细胞 TGFb 特征也被富集，但诱导的基因在很大程度上与成纤维细胞中的基因重叠。 由于 Tgfbr2 KO KP 癌细胞对 TGFβ 没有反应，并且一些上调基因对 TGFβ 激活的成纤维细胞（包括 Cald1 和 Eln）具有特异性，这使得 TGFβ 特征很可能源自 Tgfbr2 KO 肿瘤中的成纤维细胞。
这些发现表明，KP 肺癌细胞上 Tgfbr2 缺失的结果是肿瘤中 TGFβ 表达增加以及 TME 中 TGFβ 通路激活。 这表明我们在 Tgfbr2 KO 病变中观察到的基质重塑和免疫排斥的潜在机制是癌症相关成纤维细胞的 TGFβ 激活。 还证明，空间转录组学可以整合到 Perturb-map 中，以空间分辨的方式提供不同基因扰动的无偏分子分析。
这部分有几个问题需要大家注意：
- 第一个，k-means聚类，这个地方相信大家都知道稀疏性矩阵不适合kmean聚类，作者这里这么用，大家理解么？？
- 第二个，对肿瘤的spot使用的是graph-base clustering的方法，为什么不重复使用kmeans聚类了？？而且注意这里的聚类跟空间相关性特别强，这也是空间聚类区别于单细胞的地方。
- 第三个，注意对空间的运用，肿瘤内和肿瘤外围的特征基因分析，不同的区域空间信息是不同的，这也是异质性的体现。
最后，研究人员通过小鼠肺癌模型，在体内验证了与Tgfbr2 KO肿瘤相关的Perturb-map表型。实验结果显示，与Perturb-map的观察结果一致，与对照病灶相比，Tgfbr2 KO肿瘤的病灶明显增大，覆盖肺部区域也明显增多，而且许多 Tgfbr2 肿瘤具有纤维粘液基质，Tgfbr2 肿瘤内CD4+和CD8+ T细胞浸润也显著减少，由此证实了Tgfbr2的缺失重塑了KP肺癌的TME。
Method（重点已经标注）
Clonality assessment
Spatial transcriptomics analysis
生活很好，有你更好
